IκB-α、MMP-9在食管癌中的表达及其生物学意义

刘　亮，王　莉，倪晓辰，武中林，王光大，赵　阳，左　静，王　静，左连富

[作者单位]　050011 石家庄，河北医科大学第四医院肿瘤研究所流式细胞室



IκB-α、MMP-9在食管癌中的表达及其生物学意义

刘亮，王莉，倪晓辰，武中林，王光大，赵阳，左静，王静，左连富

[作者单位]050011 石家庄，河北医科大学第四医院肿瘤研究所流式细胞室

[摘要]目的检测核因子κB(NF-κB)的抑制蛋白α(inhibitor of NF-κB α, IκB-α)及基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)在不同食管病变组织中的表达，探讨IκB-α、MMP-9与食管癌发生、发展及转移的关系。方法通过免疫组织化学检测食管鳞癌、食管不典型增生组织及食管正常黏膜组织中IκB-α、MMP-9蛋白的表达；分析食管鳞癌组织中IκB-α、MMP-9蛋白表达与不同临床病理特征的关系，并对食管鳞癌组织中IκB-α与MMP-9蛋白表达相关性进行分析。结果食管鳞癌组织中IκB-α蛋白的表达(80.0%)明显高于食管不典型增生组织(52.3%)及食管正常组织(8.3%)，差异有统计学意义(P<0.05)，且与淋巴结转移及浸润深度有关。MMP-9蛋白在食管鳞癌组织中的表达(73.3%)明显高于食管不典型增生组织(71.4%)及食管正常组织(16.7%)，差异有统计学意义(P<0.05)，且与细胞分化程度、淋巴结转移及浸润深度有关。食管癌组织中IκB-α与MMP-9蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论IκB-α、MMP-9蛋白在食管癌组织中异常表达，参与了食管癌浸润、转移的发生。

[关键词]食管鳞状细胞癌；免疫组织化学；基质金属蛋白酶；浸润，转移

食管癌是较常见的恶性肿瘤，发病率及病死率高[1]，全世界每年约有30万人死于食管癌，我国是世界上食管癌高发地区，每年平均病死约15万人，食管癌已严重危害了人们的生命健康，多数患者就诊时已是中晚期，有了远处转移，失去手术治疗机会，影响生存期及生活质量。浸润转移是食管癌临床治疗中的一大难题，也是影响食管癌临床治疗效果的主要因素。因此，探寻食管癌的发生、发展和浸润转移的分子机制显得格外重要。文献报道，细胞外基质降解和再塑形对恶性肿瘤远处转移起着非常重要的作用。核因子κB是重要的核转录因子，在信号转导途径中起着枢纽的作用，调节机体免疫、肿瘤的发生发展[2-4]及细胞的凋亡过程。其抑制蛋白α(inhibitor of NF-κB α, IκB-α)可以抑制NF-κB作用，NF-κB基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)属于MMP家族，主要功能是降解和重塑细胞外基质的动态平衡[5]。本课题利用免疫组织化学的方法研究食管鳞癌组织中IκB-α及MMP-9蛋白表达，探讨其与食管癌发生发展及浸润、转移的关系。

1资料与方法

1.1一般资料45例经病理检查证实为食管癌临床标本均取自河北医科大学第四医院病理科，所取标本来源的食管癌患者术前均未接受过放疗、化疗及免疫治疗，其中男30例，女15例，年龄35~78岁，中位年龄56.5岁。取距肿瘤边缘2 cm的癌旁不典型增生组织21例，距肿瘤边缘5 cm的正常食管黏膜组织24例作对照。以4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，用于免疫组织化学检测。

1.2主要试剂兔抗人IκB-α抗体(C-21)及鼠抗人MMP-9抗体(2C3)(购自美国Santa Cruze公司)；即用型SP-9000试剂盒及DAB显色试剂盒(购自北京中杉生物技术有限公司)。

1.3免疫组织化学方法检测IκB-α及MMP-9蛋白表达4%多聚甲醛固定的组织标本经石蜡包埋后，4 μm切片2张，分别进行IκB-α及MMP-9蛋白的免疫组织化学染色。常规链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(streptavidin-perosidase， SP)方法进行免疫组织化学染色，依据参考文献[6-7]报告的方法，免疫组织化学结果以细胞浆和/或细胞核中呈现棕黄色颗粒为阳性细胞(IκB-α蛋白)，或以细胞浆呈现棕黄色颗粒为阳性细胞(MMP-9蛋白)。对每张切片随机选取5个高倍视野，每个视野计数200个细胞，共计1000个，计数阳性细胞并计算其所占比例：阳性细胞<5%，判定为阴性表达，阳性细胞≥5%，判定为阳性表达。

1.4统计学方法应用SPSS11.5统计学软件完成实验数据统计，计数资料以率(%)表示，采用χ2检验，以α=0.05为检验水准。

2结果

2.1不同食管病变组织中IκB-α及MMP-9蛋白表达IκB-α蛋白在食管鳞癌组织中阳性表达率(80.0%，36/45)显著高于不典型增生及正常组织中的表达(52.3%，11/21及8.3%，2/24)(P<0.01)，见图1A。MMP-9在食管鳞癌、不典型增生及正常组织中阳性表达率分别为73.3%(33/45)、71.4%(15/21)及16.7%(4/24)，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1B。

图1　食管鳞癌组织中IκB-α及MMP-9蛋白表达(SP ×200)A为核因子κB抑制蛋白α；B为基质金属蛋白酶-9

2.2食管鳞癌组织中IκB-α及MMP-9蛋白表达与不同临床病理特征的关系如表1所示，IκB-α蛋白在食管鳞癌组织中阳性表达，有淋巴结转移者表达率为(92.0%，23/25)显著高于无淋巴结转移者(65.0%，13/20)(P<0.05)，浸润纤维膜者(89.7%，26/29)显著高于无纤维膜浸润者(62.5%，10/16)(P<0.05)，而与年龄、性别及细胞分化程度无关(P>0.05)。MMP-9蛋白在食管鳞癌细胞高中低分化组织中阳性表达率分别为50.0%(9/18)、85.7%(12/14)及(92.3%12/13)，差异有统计学意义(P<0.05)；有淋巴结转移的组织中表达为88.0%(22/25)显著高于无淋巴结转移者55.0%(11/20)(P<0.05)；浸润纤维膜者表达率为86.2%(25/29)显著高于无纤维膜浸润者50.0%(8/16)(P<0.05)；MMP-9与患者年龄及性别无关(P>0.05)。

2.3食管鳞癌组织中IκB-α及MMP-9蛋白表达相关性分析食管鳞癌组织中IκB-α蛋白表达与MMP-9蛋白差异无统计学意义，spearman相关系数γ=0.201，P=0.185。

表1　45例食管癌组织中IκB-α与MMP-9蛋白表达与不同临床病理特征的关系

3讨论

食管癌是我国较常见的恶性肿瘤，河北磁县及河南林州是食管癌高发区，发病率及病死率均较高，严重威胁了人们的生命健康[8-10]。多数患者就诊时已是中晚期，治疗效果不佳，探寻食管癌发生、发展及转移机制，有利于临床上提高食管癌的治疗效果及生存期。核转录因子NF-κB广泛存在于真核生物中，是一个由复杂的多肽亚单位组成的蛋白家族，在信号转导途径中起着枢纽的作用，调节机体免疫、肿瘤的发生发展及细胞的凋亡过程[11-15]。与NF-κB密切相关的是在细胞浆中存在另一蛋白质家族-IκB，它的主要作用是与NF-κB/Rel蛋白在胞浆中结合并使后者保持静息状态。IκB家族包括IκBα、IκBβ、Bcl-3、IκBγ、P105、P100等，其中IκBα通过其锚蛋白与位于NF-κB的RHD区域末端的核定位信号(NLS)结合，并遮蔽NLS使NF-κB滞留在胞浆中呈非活性状态。IκBα可调控NF-κB生理功能，有研究显示，IκBα参与多种肿瘤发展及转移[16-19]。高黎等[20]研究显示，IκBα蛋白在口腔鳞癌组织中的阳性表达率显著高于正常口腔黏膜组织中的阳性表达率。尉坤等[21]研究显示，大肠癌组织中IκBα蛋白表达水平明显低于正常组织，且与大肠癌侵袭和转移有关。郭红娟等[22]研究发现，IκBα基因及蛋白在非小细胞肺癌中的表达显著低于癌旁肺组织。在本实验中，利用免疫组化的方法检测了不同食管病变组织中的IκBα蛋白的表达水平，食管癌组织中的表达水平显著高于不典型增生及正常组织，且在食管癌的淋巴结转移及浸润深度密切相关，提示IκBα参与了食管癌的淋巴结转移过程。本实验研究的IκBα在癌组织中的表达趋势与高黎及郭红娟等研究结果不一致，可能是IκBα在不同癌组织中参与浸润及转移的机制不同，因此需要进一步研究IκBα参与癌组织浸润及转移机制。

恶性肿瘤细胞从原发部位经淋巴道、血管等途径到达其他部位继续生长形成的肿瘤转移，严重影响了患者的治疗效果及生存期，但目前肿瘤浸润转移机制仍未阐明，研究显示，浸润和转移主要依赖于细胞外基质的降解，基质金属蛋白酶(matrix metall oproteinases，MMPs)能够水解基底膜和细胞外基质, 从而促进肿瘤细胞的浸润转移。其中MMP-9可水解基底膜和细胞外基质中的Ⅳ型胶原等多种成分，在肿瘤细胞的浸润及转移中起着重要作用[23-25]。有研究显示，在乳腺癌中 MMP-2、MMP-9表达与癌组织浸润转移及预后有关[26]。本课题利用免疫组化检测不同食管病变组织中MMP-9蛋白表达水平，并分析其与食管癌不同临床病理特征关系，发现MMP-9蛋白在食管癌组织表达水平显著高于食管正常组织的表达，且与食管癌细胞分化程度、淋巴结转移及浸润深度有关。提示MMP-9蛋白参与了食管癌浸润转移过程。统计分析食管癌组织中IκBα与MMP-9蛋白表达无显著相关性。

IκBα与MMP-9蛋白在食管组织中的异常表达，参与了食管癌的发生、发展、浸润及转移过程，但两者表达水平无显著相关性，可能是通过不同机制参与了食管癌的浸润转移过程。

[参考文献]

[1]Gamliel Z. Incidence epidemiology and etiology of esophageal cancer[J].Chest Surg Clin N Am, 2000,10(3):441-450.

[2]Yang F, Li J, Zhu J,etal. Hydroxysafflor yellow A inhibits angiogenesis of hepatocellular carcinoma via blocking ERK/MAPK and NF-κB signaling pathway in H22 tumor-bearing mice[J].Eur J Pharmacol， 2015,75(4):105-114.

[3]刘林,刘修恒,王磊.氟伐他汀对大鼠肾脏缺血再灌注损伤 NF-κB 表达的影响[J].临床误诊误治,2013,26(9):86-88.

[4]杨改生,张国荣,张晋东,等.心肌缺血再灌注损伤中核因子 κB活性的变化[J].空军总医院学报,2006,22(2):80-82.

[5]Uloza V, Liutkevicius V, Pangonyte D,etal. Characteristics of expression of matrix metalloproteinases (MMP-2 and MMP-9) in glottic squamous cell carcinoma and benign vocal fold lesions[J].Clin Exp Otorhinolaryngol， 2015,8(1):57-64.

[6]姜倩.人口腔白斑及鳞状细胞癌中NF-κB/p65,cyclin D1及CD105表达的研究[J].郑州大学学报，2009,24(2):78-81.

[7]钟崇,郭荣平,石明,等.VEGF与MMP-9在肝癌组织中的表达及其临床意义[J].癌症，2006,25(5):599-603.

[8]宿涌涛,夏丽传,尹素凤.淄博市 2010-2012年居民恶性肿瘤死因分析[J].中国医药导报, 2014 , 11 ( 8 ):108-111.

[9]赫捷,邵康.中国食管癌流行病学现状、诊疗现状及未来对策[J].中国癌症杂志，2011,21(7):501-504.

[10]孙健.食管癌微创治疗进展[J].中国煤炭工业医学杂志,2014,17(1):166-170.

[11]方兴保 殷正丰,杨之斌.NF-κB与结直肠癌[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2013,20(3):356-359.

[12]Tsubaki M, Takeda T, Kino T,etal. Mangiferin suppresses CIA by suppressing the expression of TNF-α, IL-6, IL-1β, and RANKL through inhibiting the activation of NF-κB and ERK1/2[J].Am J Transl Res, 2015,7(8):1371-1381.

[13]Sui X, Zhu J, Tang H,etal. p53 controls colorectal cancer cell invasion by inhibiting the NF-κB-mediated activation of Fascin[J].Oncotarget, 2015,6(26):22869-22879.

[14]贾丽超,周明学,张 蕾,等.当归芍药散对代谢性炎性反应小鼠血脂和血清炎性反应因子IL-6、MCP-1 及 NF-κB、PPARγmRNA 表达的影响[J].首都医科大学学报，2014,35(6):25-29.

[15]Cho S C, Choi B Y. Acetylshikonin Inhibits Human Pancreatic PANC-1 Cancer Cell Proliferation by Suppressing the NF-κB Activity[J].Biomol Ther (Seoul), 2015,23(5):428-433.

[16]张建,徐永健,熊维宁,等.转染IκBα基因抑制NF-κB活性对A549细胞侵袭行为的影响[J].癌症，2008,27(7):710-715.

[17]周文鹏.NF-κB对大肠癌转移相关基因的调节及意义[D].浙江大学，2005.

[18]Wang F, Ma J, Wang K S,etal. Blockade of TNF-α-induced NF-κB signaling pathway and anti-cancer therapeutic response of dihydrotanshinone I[J].Int Immunopharmacol, 2015,28(1):764-772.

[19]Müller-Edenborn K, Léger K, Glaus Garzon J F,etal. Hypoxia attenuates the proinflammatory response in colon cancer cells by regulating IκB[J].Oncotarget, 2015,6(24):20288-20301.

[20]高黎,张彦喜,石爱梅.核因子-κBp65与IκBα在口腔白斑及鳞癌中的表达[J].实用口腔医学杂志,2009,25(1):58-61.

[21]尉坤,孙伟,李秉慧,等.NF-κB及其抑制蛋白I-κBα与大肠癌侵袭和转移的相关性[J].中国老年学杂志,2009,29(15):1870-1872.

[22]郭红娟,朱光发,吴春婷,等.NF-κBp65/IκBα在非小细胞肺癌组织中的表达[J].临床肺科杂志,2014,19(2):267-271.

[23]江忠清,朱凤川,曲军英,等.宫颈癌MMP-9表达与肿瘤血管生成、癌细胞增殖及侵袭转移的关系[J].癌症,2003,22(2):178-184.

[24]周少飞,毛伟征,苗蕾,等.基质金属蛋白酶-9及其抑制剂与甲状腺乳头状癌的关系[J].疑难病杂志,2014,11(9):676-678.

[25]高艳章,谈宗明.胃癌患者促血管生成相关因子与 MMPs对病情进展的判断意义[J].解放军预防医学杂志,2015,33(2):185-186.

[26]袁莲香,何伟民,张斌,等.乳腺癌组织MMP-2、MMP-9和TIMP-2蛋白表达与肿瘤的转移及预后[J].肿瘤,2002,22(4):294-296.

(收稿时间：2015-09-21修回时间：2015-10-22)

·论著·

Expressions of IκB-α and MMP-9 in Esophageal Cancer and Its Biological Significance

LIU Liang, WANG Li, NI Xiao-chen, WU Zhong-lin, WANG Guang-da, ZHAO Yang, ZUO Jing, WANG Jing, ZUO Lian-fu (Department of FCM Analysis, Tumor Institute, the Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, China)

[Abstract]ObjectiveTo detect the expressions of inhibitor of NF-κB α (IκB-α) and matrix metalloprotein-9 (MMP-9) protein of nuclear factor kappa B (NF-κB) in different esophageal lesion tissues and to explore the relationship between IκB-α and MMP-9 expressions and pathogenesy, development and metastasis of esophageal cancer. MethodsThe IκB-α and MMP-9 protein expressions in esophagus squamous cell carcinoma, esophageal atypical hyperplasia and normal esophageal tunica mucosa tissues were detected using immunohistochemistry method; the relationship between the IκB-α and MMP-9 protein expressions in tissues of esophagus squamous cell carcinoma and different clinicopathological features were analyzed as well as the relationship between IκB-α and MMP-9 expressions in tissues of esophagus squamous cell carcinoma. ResultsThe IκB-α protein expression in tissues of esophagus squamous cell carcinoma (80.0%) was significantly higher than 52.3% in tissues of esophageal atypical hyperplasia and 8.3% in normal esophageal tissues, and the differences were statistically significant (P<0.05), and the differences were related to lymph node metastasis and invasion depth. The MMP-9 protein expression in tissues of esophagus squamous cell carcinoma (73.3%) was significantly higher than 71.4% in tissues of esophageal atypical hyperplasia and 16.7% in normal esophageal tissues, and the differences were statistically significant (P<0.05), and the differences were related to cell differentiation degree, lymph node metastasis and invasion depth. IκB-α and MMP-9 protein expressions in esophageal cancer tissues did not have significant correlation (P>0.05). ConclusionThe abnormal expressions of IκB-α and MMP-9 protein in esophageal cancer is involved in the invasion and metastasis of esophageal cancer.

[Key words]Esophagus squamous cell carcinoma; immunohistochemistry; Matrix metalloproteinases; Invasion, metastasis

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.12.007

[文献标志码][中国图书资料分类号]R735.1A

[文章编号]2095-140X(2015)12-0032-04

[通讯作者]左连富，E-mail:zuolianfu4909@sina.com