金雀异黄素对胶原诱导关节炎大鼠发病的预防作用

柳桂萍++++++张育++++++王雯雯++++++刘家欢++++++许金鑫

[摘要] 目的 研究金雀異黄素（Gen）对Ⅱ型胶原诱导型关节炎（CIA）大鼠发病的预防作用。 方法 24只大鼠随机分为三组：空白对照组、模型对照组及Gen预防用药组，每组8只。在造模前，预先给予Gen预防用药组大鼠胃内灌注Gen 1周，使用Ⅱ型胶原建立模型对照组及Gen预防用药组的CIA模型。观察关节炎指数（AI）评分及关节肿胀度；通过免疫组化检测微血管密度（MVD），评估关节滑膜的血管新生情况；应用免疫印迹法检测炎性细胞因子（IL-1β、TNF-α）和血管新生相关调节因子（VEGF、MMP-1、MMP-2、MMP-9）的表达。 结果 CIA大鼠造模成功。与模型对照组比较，Gen预防用药组大鼠炎性反应较轻，差异有统计学意义（P < 0.05）。与模型对照组相比，Gen预防用药组大鼠血清中IL-1β、TNF-α的表达明显降低（P < 0.05）。与模型对照组相比，Gen预防用药组大鼠血清中VEGF表达降低，关节滑膜新生血管的形成减少，差异有统计学意义（P < 0.05）。预防性使用Gen能够降低CIA大鼠血清中MMP-1、MMP-2、MMP-9表达，与模型对照组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 Gen能够通过调节CIA大鼠体内炎性细胞因子，抑制血管新生相关调节因子的表达，阻止软骨及骨的进一步破坏，对风湿性关节炎发病起到一定的预防作用。

[关键词] 金雀异黄素；滑膜微血管密度；基质金属蛋白酶

[中图分类号] R593.22 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）11（b）-0025-05

[Abstract] Objective To investigate the prevention effects of Genistein （Gen） in collagen Ⅱ induced arthritis （CIA） rats. Methods 24 rats were randomly divided into three groups and each group contained 8 rats： blank control group， model control group and Gen prevention group. Before establishing the CIA rat model， the rats in Gen prevention group were given Gen by gavage for one week. The rats in model control group and Gen prevention group were given collagen Ⅱ to induce CIA model. Arthritis index scores and swell arthrosis were observed in CIA rats. Immunohistochemistry assay was used to examine microvascular density （MVD）， for further evaluation of angiogenesis in the synovial membrane of the joint. Western blot was used to detect the expression of inflammatory factors （IL-1β， TNF-α） and angiogenesis related regulatory factors （VEGF， MMP-1，MMP-2， MMP-9）. Results The CIA model was successfully constructed. In Gen prevention group， the inflammatory reaction of rats was lighter than model control group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. Compared with the model control group， the expressions of IL-1β and TNF-α in serum of Gen prevention group were significantly decreased （P < 0.05）. Compared with the model control group， the expression of VEGF in serum and the number of new blood vessels in synovium of Gen prevention group were decreased， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. Compared with model control group， taken Gen as a prevention could reduce the expression of MMP-1， MMP-2， MMP-9 in serum of CIA rats， and had statistical differences （P < 0.05）. Conclusion Gen plays a certain preventative role in developing of rheumatoid arthritis. The mechanism may function by regulating the inflammatory factors， inhibiting the expression of angiogenesis related regulatory factors and restricting the further destruction of cartilage and bone.

[Key words] Genistein； Microvessel density； Matrix metalloproteinase

风湿性关节炎（RA）的主要病理特点是在炎性环境中受各种炎性细胞因子如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）和血管内皮生长因子（VEGF）的刺激，关节成纤维样滑膜细胞（FLS）显著增殖和微血管新生[1-2]，并进一步产生基质金属蛋白酶（MMPs）、蛋白溶解酶类及前列腺素等物质，破坏关节软骨及骨结构，从而导致关节畸形及功能障碍[3]。如能在发病早期及时进行有效的干预，则对RA的病情控制具有重要意义。笔者前期工作发现，金雀异黄素（Gen）能够调节RA成纤维样滑膜细胞凋亡蛋白的表达，抑制其增殖，并能降低Ⅱ型胶原诱导型关节炎（CIA）大鼠成纤维样滑膜细胞分泌IL-1β、TNF-α等炎性细胞因子[4-6]。本研究应用体内实验进一步观察Gen对CIA大鼠发病的预防作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用南京医科大学实验动物中心提供的雌性SD大鼠（清洁级），4周龄，体重为（120±20）g，动物许可证号：SCXK（苏）2007-0001。

1.2 实验材料

鸡Ⅱ型胶原、完全弗氏佐剂、二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司；DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；Gen纯品（纯度≥99%）购于上海融禾医药科技发展有限公司；IL-1、TNF-α、VEGF、MMP-1、MMP-2、MMP-9抗体，辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗购于美国CST公司；其余试剂均为进口分装或市售分析纯。

1.3 药物的配制

参照文献[4]配制Ⅱ型胶原乳剂及Gen混悬液。

1.4 实验方法

1.4.1 动物模型的建立

1.4.1.1 实验动物分组及处理 24只大鼠随机分成三组：空白对照组、模型对照组及Gen预防用药组，每组8只大鼠。Gen预防用药组大鼠在造模前1周开始每天胃內灌注Gen混悬液1 mL。空白对照组以及模型对照组大鼠每天灌注等量羧甲基纤维素钠。

1.4.1.2 造模 模型对照组和Gen预防用药组大鼠左后足趾皮下注射0.1 mL Ⅱ型胶原乳剂，并于3周后在尾根部进行多点加强注射，空白对照组注射等量的注射用水。

1.4.2 动物模型的评价

关节炎指数（AI）评分及关节肿胀度测定，参照文献[4]。

1.4.3 免疫组化检测

在给药4周后处死所有大鼠，常规病理学及免疫组化法检测滑膜炎症及血管新生，参照文献[7]用Mouse Anti-CD31标记滑膜微血管，进行滑膜微血管密度（MVD）测定。

1.4.4 免疫印迹（Western blot）法检测

造模4周后处死大鼠，心脏采血5 mL，分离血清，参照文献[8]检测Gen预防性用药后CIA大鼠血清炎性因子（IL-1β、TNF-α）、血管新生相关调节因子（VEGF、MMP-1、MMP-2、MMP-9）表达的变化。每个实验样本重复3次。

1.5 统计学方法

采用SPSS 10.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠造模后一般情况

造模组大鼠造模后当天后肢注射部位开始出现肢体肿胀，随后发现对侧和前肢关节也出现了肿胀，以后肢关节肿胀更为明显，部分大鼠关节表面皮肤充血且有关节活动障碍。造模组大鼠与空白对照组大鼠相比，精神萎靡，进食减少，运动迟缓，体重增长减慢，毛发缺少光泽。

2.2 三组大鼠关节炎指数比较

AI评分结果显示，空白对照组大鼠无关节炎性反应，从造模后1周开始，模型对照组的AI评分均明显高于空白对照组（P < 0.05）；从第3周开始Gen预防用药组AI评分低于模型对照组（P < 0.05），见图1。分析足肢肿胀程度结果发现，CIA大鼠关节肿胀于造模后开始增加，模型对照组于第3周达到高峰，Gen预防用药组于第2周达到高峰，以后逐渐降低。见图2。

2.3 各组大鼠血清中IL-1β、TNF-α表达比较

模型对照组大鼠IL-1β、TNF-α的表达均明显高于正常对照组（P < 0.05），Gen预防用药组IL-1β、TNF-α的表达均明显低于模型对照组（P < 0.05），但仍高于空白对照组大鼠（P < 0.05）。见图3。

2.4 各组大鼠血清中VEGF表达比较

研究发现，与空白对照组相比，模型对照组大鼠VEGF表达明显升高（P < 0.05），Gen能明显抑制CIA大鼠血清中VEGF表达（P < 0.05），但仍高于空白对照组。见图4。

2.5 各组大鼠关节滑膜免疫组化结果及MVD比较

采用Mouse Anti-CD31标记关节滑膜组织中的内皮细胞，计数大鼠关节滑膜组织中单位密度的微血管数（图5～6）。统计结果显示，模型对照组大鼠关节滑膜中的微血管数目明显多于空白对照组（P < 0.05）；Gen预防用药组大鼠的关节滑膜微血管数目仍高于空白对照组，但明显低于模型对照组（P < 0.05）。

2.6 各组大鼠血清中MMP-1、MMP-2、MMP-9表达比较

研究发现，与空白对照组相比，模型对照组大鼠MMP-1、MMP-2、MMP-9的表达均明显升高（P < 0.05）；而Gen预防用药组大鼠血清中MMP-1、MMP-2、MMP -9的表达水平明显低于模型对照组，但仍高于空白对照组（P < 0.05）。见图7。

3 讨论

Gen是大豆中生物活性最强的异黄酮之一，现已证实Gen可用于预防和治疗多种疾病[9-12]。TNF-α、IL-1β是RA发生的重要炎性细胞因子。TNF-α和IL-1β相互协同下促进RA关节滑膜组织增生；诱导关节成纤维样滑膜细胞和软骨细胞产生胶原酶和前列腺素E2；增加血管内皮细胞黏附分子表达，促使血管生成；影响糖蛋白的代谢，抑制骨形成，最终导致关节结构破坏[13]。本研究发现，模型对照组大鼠与空白对照组相比，其血清中IL-1β、TNF-α的表达明显增高（P < 0.05）；预防性给予Gen干预后，IL-1β、TNF-α表达明显降低，但并未恢复到正常水平，提示Gen能够通过部分调节CIA大鼠体内炎症因子的表达而预防RA的发病。

血管新生失去控制是RA滑膜增生以及关节软骨侵蚀的主要因素。研究表明，VEGF能促进新生血管的生成[14]。Yi等[15]研究证实，RA患者血清、关节滑膜组织和滑膜液中VEGF含量与疾病活动度具有相关性。RA病程中VEGF可诱导关节滑膜毛细血管内皮细胞增殖和迁移，引起关节滑膜血管新生及血管翳形成，并能通过增加毛细血管的通透性而促进炎性物质的渗出。新生血管形成的过程中首先是毛细血管内皮下基底膜被MMPs等物质降解，提示MMP-1、MMP-2、MMP-9在促进RA关节滑膜血管新生的过程中发挥重要作用[16-18]。关节滑液及滑膜组织中过量表达的MMP-1、MMP-2、MMP-9可通过降解关节软骨成分直接参与RA关节软骨基质的分解，最终导致骨结构破坏[19]。Sbardella等[20]研究表明，测定血清中MMPs含量可以间接反映关节滑液中MMPs的变化情况。本实验结果显示：Gen预防用药组大鼠滑膜组织中的MVD明显多于空白对照组（P < 0.05），但与模型对照组比明显减少（P < 0.05）；Gen预防性干预后，可以明显抑制CIA大鼠血清中VEGF表达（P <0.05）；且CIA大鼠血清中MMP-1、MMP-2、MMP-9表达水平明显减低（P < 0.05）。这表明Gen可以通过下调CIA大鼠体内的VEGF、MMP-1、MMP-2、MMP-9的表达抑制关节滑膜血管新生，并可直接阻止关节软骨及骨的破坏以达到防止RA的发病的目的。

综上所述，预防性应用Gen能够下调炎性細胞因子（TNF-α和IL-1β）的表达；下调血管新生相关调节因子（VEGF和MMP-1、MMP-2、MMP-9）的表达而抑制关节滑膜的血管新生，阻止关节软骨及骨的破坏，对RA的发病有一定的预防作用。

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