基质金属蛋白酶—1基因启动子区（—1607）基因多态性与肾移植后环孢素诱导牙龈增生的相关性

戴巧群+单海琴+任雨+吴寅+孙科家+叶小磊

[摘要] 目的 研究MMP1基因单核苷酸多态（-1607）1G/2G与环孢素诱导牙龈增生（CsA-GO）发生风险的关系。 方法 以聚合酶链反应和限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析方法，分别检测42例环孢素诱导牙龈增生病人和118位正常对照者MMP1（-1607）1G/2G多态的基因型；以Logistic回归模型计算不同基因型与环孢素诱导牙龈增生风险的关系。 结果 环孢素诱导牙龈增生病例组的MMP1（-1607）3种基因型频率分布与对照组无显著差异（P=0.37）。携带MMP1（-1607）2G基因型者发生环孢素诱导牙龈增生的风险比携带1G基因型者高1.38倍（95%CI=0.81～2.36，P=0.24），而1G基因型与环孢素诱导牙龈增生风险无关。 结论 MMP1基因启动子区（-1607）1G/2G单核苷酸多态性可能并非环孢素诱导牙龈增生的遗传易感因素，携带2G基因型的患者发生CsA-GO的风险有增高趋势。

[关键词] 牙龈增生；基质金属蛋白酶；基因多态性；遗传易感性

[中图分类号] R781.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）30-0152-04

环孢菌素（Cyclosporine，CsA）作为临床常见的免疫抑制剂，主要应用于器官移植后的抗宿主排异反应，在临床应用过程中可诱发药物性牙龈增生（drug-induced gingival overgrowth，DGO），由CsA诱导的牙龈增生（CsA-GO）在肾移植后患者中发病率可以高达30%～50%。牙龈增生后不仅可以影响患者口腔的咀嚼以及美观，而且为口腔微生物的生长提供了较佳的环境，可以增加免疫功能抑制患者系统感染的风险，导致严重并发症的发生[1]。对使用CsA患者进行牙龈增生易感性研究，可以减少易感患者发生牙龈增生的可能性，为免疫抑制剂的使用提供指导。

正常牙龈由上皮层和固有层构成，前者属于上皮组织，附着于牙釉质或牙骨质的表面，后者主要为结缔组织，包括细胞和细胞外基质两部分，胞外基质中含有大量的胶原纤维，约占细胞外基质的60%。牙龈组织中的胶原I主要来源于牙龈成纤维细胞，基质金属蛋白酶-1是负责I型胶原降解的主要蛋白水解酶，正常情况下，胶原I合成和降解处于平衡状态。以往不少研究认为，CsA-GO发生可能与牙龈组织胶原代谢失衡有关，即合成-降解失衡[2]。有研究发现，在环孢素作用下基质金属蛋白酶-1（MMP1）活性下调，牙龈结缔组织I型胶原降解受抑制，产生的胶原因无法降解而堆积[3，4]。对MMP1基因活性调节位点的研究显示，在该基因启动子区域上游1607位点1G/2G的多态性可以直接影响MMP-1的转录活性和蛋白表达水平[5]，并与多种疾病的易感性存在相关性，如结直肠癌[6]、子宫内膜异位症[7]等。而在口腔领域，Santos等发现种植体失败患者2G型的比例明显高于对照组[8，9]。国内外不少研究发现[10，11]，该位点多态性与口腔鳞癌的易感性密切相关。以上研究说明，MMP1的活性影响到I型胶原代谢。目前，国内外尚未有关于MMP1多态性与环孢素诱导的牙龈增生的研究报道，因此，本研究着重探讨MMP1上游启动子区域-1607位点多态性与环孢素诱导的牙龈增生的相关性。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取我院2011年1月～2013年12月期间服用CsA达到6个月以上的肾移植患者160例，其中男125例，女35例，年龄18～60岁，术后最长时间6年，近3个月来未经任何牙周治疗，根据是否存在牙龈增生分为牙龈增生组42例和未诱发牙龈增生组（对照组）118例，牙龈增生程度评估在Angelopoulos和Goaz等人方法基础上有所调整，即0=无牙龈增生，1分=轻度牙龈增生；牙龈边缘增厚，龈袋内有小叶状颗粒增生，增生的牙龈覆盖少于1/3牙冠；2分=中度牙龈增生；增生牙龈覆盖至牙冠中部；3分=重度牙龈增生；2/3以上牙冠被增生牙龈覆盖或全附着龈均有增生[12]。评估研究对象发现，在牙龈增生组中为（1.96±0.61），在对照组中为（0.02±0.01），差异具有统计学意义（P<0.05）。血液中环孢素浓度在增生组中为（333.0±111.8）μg/mL，对照组中为（288.8±80.1）μg/mL，差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2 DNA提取

抽取患者前臂静脉血2 mL，以枸橼酸钠抗凝，采用北京天根TIANamp 血液基因组DNA提取试剂盒（DP318），提取外周血中白细胞DNA，方法参考试剂盒说明书。

1.3 基因多态性检测

MMP1基因分型：采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法对MMP1基因上游-1607区域进行扩增。MMP1（-1607）1G/2G引物设计以及方法按文献报道进行[9]。扩增含该多态位点的PCR引物序列为上游引物5′-TGAGGAAATTGTAGTTAAATCCTTAGAAAG -3′和下游引物5′-TGAGGAAATTGTAGTTAAATCCTTAGAAAGTCTT -3′。PCR反应体系设置如下。北京百泰克2×Power Taq PCR MasterMix 12.5 μL（含相关的PCR Buffer以及Taq聚合酶），上下游引物各0.2 μL，DNA模板1 μL，其余用水补齐反应体积到25 μL；PCR条件为：95℃变性2 min，然后94℃30 s，53℃30 s，72℃50 s进行30个循环后，72℃延伸6 min。由于在上游引物21位中引入错配碱基CC，因此产物能用于BslI的酶切，大小为130bp。取15μL PCR产物与限制性核酸内切酶BslI（New England BioLabs）于37℃孵育3 h。酶切产物于3.0%琼脂糖凝胶电泳分离。经过酶切后，1G/1G基因型产生的片段大小为130bp；2G/2G产生27bp和103bp；杂合子则产生大小分别为130bp、103bp和27bp 的3个片段。每一批PCR反应均以蒸馏水替代DNA模板作为阴性对照，并设置杂合子患者为内对照，用于判断每次酶切反应是否彻底，并随机抽取10%的DNA标本对PCR产物进行测序分析以判断方法的正确性。endprint

1.4数据及统计分析

得到患者以及对照组不同分型基因频率后，分析是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。同时采用SPSS 10.0软件进行数据分析，用χ2检验比较各基因型频率在病例组与对照组之间的差异。用比值比（oddsratio，OR）及其95%可信区间（confidence interval，CI）表示携带某个基因型发生环孢素诱导牙龈增生的风险度。OR值以非条件Logistic回归计算，并经性别、年龄状况校正。

2 结果

见表1。在42个牙龈增生组中，MMP1（-1607）1G/1G、1G/2G和2G/2G这3种基因型的分布频率分别为9.5%、40.5%和50.0%，在118个正常对照中，1G/1G、1G/2G和2G/2G的分布频率分别为16.1%、41.5%和42.4%， 2个不同分组基因频率分布经Hardy-Weinberg平衡定律（H-W test）检测，显示均符合H-W 分布（P>0.05）。Pearson卡方检验表明，这三种基因型在牙龈增生和对照组中差异无统计学意义（χ2=1.99，P=0.37）。Logistic回归分析结果表明，以MMP1（-1607）1G/1G基因型携带者为参照，携带2G基因型者罹患牙龈增生患者的OR风险为携带1G基因的1.38倍（95%CI 0.81～2.36），因此，携带2G基因的患者发生CsA-GO的风险增加，但由于CI下限为0.81并未超过1，还不足以认为2G为易感的风险因素。

3 讨论

CsA-GO的发生常与牙龈下结缔组织中胞外基质的堆积有关，其构成以I型胶原为主，另外也存在3型胶原以及蛋白多糖等的积聚。牙龈组织中的胶原降解主要通过基质金属蛋白酶-1和-3实现。基质金属蛋白酶家族（MMPs）是一组锌离子或钙离子依赖酶，以无活性的酶原形式分泌后可通过纤溶酶、胰蛋白酶或其他因子刺激后，剪接活化并降解1种或者多种细胞外基质成分，在细胞外基质代谢调节中起重要作用。CsA-GO的发生常与胶原代谢紊乱相关，其中MMPs活性以及表达受到较多研究的关注。Rutter等[13]在MMP1基因启动子区上游1607位发现一个插入/缺失多态性，多出鸟嘌呤，使得位点区域序列变为5'-GGA-3'，该型就是2G型，而只有1个鸟嘌呤的为1G型。该位点SNP普遍存在，正常个体中3种基因型比例分别为1G/1G 30%、1G/2G 30%、2G/2G 3%～40%，在癌细胞中2G/2G型的比例可提高到63.5%，与较强的基质降解并促进癌细胞转移密切相关。其中2G等位基因形成一个转录因子ETS的核心结合序列，研究显示ETS-1可以提高MMP-1启动子活性达到10倍[14]，同时也发现ETS可以通过动态调节MMP1和TIMP1酶系统的平衡而影响胶原的沉积，进而参与到化疗药物诱导的肾病ECM的重塑过程[15，16]。另一方面，1G等位基因则使得MMP1转录显著降低。

由于MMP1基因启动子多态性使得MMP1的表达在不同人中存在较大的差异，因此不同的人对CsA所诱导的牙龈增生也存在易感性的差异。而且CsA可以抑制来自牙龈成纤维细胞中MMP-1的活性，且呈现浓度依赖性[3]。因此，CsA可以使得MMP1的表达和活性在不同人中存在一定程度的下降，进而引起胶原无法被有效降解，引起堆积增加。本研究显示，牙龈增生以及未增生组中MMP1上游（-1607）基因多态性基因之间的分布无显著差异，提示我们这一位点的多态性可能和CsA-GO发病无显著关系，进一步的Logistic回归分析显示，携带1G基因型的患者发生CsA-GO的风险为携带2G基因型患者的0.73倍，95%CI为0.42～1.24，因此说明该位点并非发生CsA-GO的危险因素。

MMP1启动子多态性与口腔疾病的报道主要集中于与牙周炎发展的相关性，但是研究结果存在争议，部分研究认为，含有2G/2G的患者发展为重度慢性牙周炎的风险远高于1G等位基因的患者。也有一些研究显示MMP1启动子区域-1607位点多态性并非慢性牙周炎的风险因素，在不同分组中不存在统计学差异[17]。这些结果提示由于不同研究的种族差异、实验样本容量的差异以及试验方法的不同，使得SNP与口腔疾病如牙周炎发展中的作用研究还处于探讨阶段。由于牙龈胶原代谢还和MMP家族中MMP3的活性有关，而MMP3和MMP1都定位于11q22.3上，两者的分布频率和连锁不平衡性可能也影响到口腔疾病的易感性。

总之，本研究首次在CsA-GO患者中探讨了MMP1基因启动子区域位点多态性与疾病发展的相关性。根据现有样本结果分析显示，MMP1基因启动子区的功能性单核苷酸多态（-1607） 1G/2G与环孢素诱导牙龈增生的发生无显著相关，但是携带2G等位基因的患者发生CsA-GO的风险增加。由于本研究的样本量相对较小，还需要进一步扩大研究对象，并且收集更多的临床预后资料，以探讨该基因其他位点多态性以及相关基因如MMP3多态性对环孢素诱导牙龈增生易感性的相关性。

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