罗红霉素对香烟烟雾暴露小鼠HDAC2的影响

徐慧+戴元荣+胡丹红+夏梦玲

[摘要] 目的 观察罗红霉素对烟雾暴露哮喘小鼠组蛋白去乙酰化酶（HDAC2）表达的影响，探讨罗红霉素对烟雾暴露哮喘患者可能的治疗作用。方法 SPF级雌性BALB/c小鼠40只，按随机数字表法随机分为对照组（C）、哮喘组（A）、烟雾暴露组（S）、罗红霉素组（R）4组。用卵白蛋白（OVA）致敏和激发的方法制备哮喘和烟雾暴露模型，并用罗红霉素干预。观察各组小鼠肺组织病理超微结构变化，分析支气管肺泡灌洗液（BALF）中的细胞分类计数，并采用Western blot法测定各组小鼠肺组织中HDAC2表达情况。结果 哮喘组和烟雾暴露组嗜酸粒细胞计数比例均显著高于对照组（均P<0.01），烟雾暴露组中性粒细胞计数比例显著高于哮喘组（P<0.01）；罗红霉素组与烟雾暴露组相比，嗜酸性粒细胞，中性粒细胞比例明显下降（P<0.01）。哮喘组和烟雾暴露组肺组织HDAC2表达均低于对照组，烟雾暴露组低于哮喘组（均P<0.01）， 罗红霉素组肺组织HDAC2表达高于烟雾暴露组（均P<0.01）。结论罗红霉素可能通过上调HDAC2，改善烟雾暴露小鼠气道炎症。

[关键词] 哮喘；香烟烟雾；组蛋白脱乙酰基酶类；罗红霉素

[中图分类号] R563.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）30-0001-03

支气管哮喘（简称哮喘）是呼吸系统的常见病和多发病，其患病率和死亡率目前呈上升趋势。嗜酸粒细胞炎症是哮喘的重要特征，而吸烟哮喘患者气道却是以中性粒细胞浸润为主。吸烟是影响哮喘发生、发展的重要危险因素，可增加哮喘发生的频率和症状的严重程度，而且烟雾暴露哮喘患者存在对激素治疗不敏感[1]等问题。因此研究吸烟哮喘患者发病机理具有重要意义。哮喘发病危险因素中最重要的是遗传和环境因素，由于遗传背景不可能在短时间内出现显著变化，因此，环境因素可能起到关键作用。研究表明组蛋白去乙酰化酶（HDAC）是激素发挥抗炎作用的中介，HDAC2活性的下降会导致哮喘患者对激素敏感性下降[2]。罗红霉素是临床上常用的大环内酯类抗生素，近年来研究发现其除了抗菌作用外，还表现出较强的抗炎活性[3]。本实验通过建立烟雾暴露哮喘小鼠模型，并用罗红霉素干预，观察罗红霉素对HDAC2的影响，为寻找对烟雾暴露哮喘患者有效药物提供新途径。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SPF级雌性BALB/c小鼠40只，体重18～22 g，由温州医科大学实验动物中心提供。红塔山牌过滤嘴香烟（云南省玉溪卷烟厂生产，焦油含量13 mg/支，烟气一氧化碳量13 mg/支）；免疫组化试剂盒和GAPDH（碧云天生物技术研究所）；HDAC2（美国CST公司）；卵白蛋白（OVA）干粉，罗红霉素粉剂（美国Sigma公司）。

1.2 实验方法

1.2.1烟雾暴露哮喘模型的复制 40只小鼠按随机数字表法随机平均分为对照组（C）、哮喘组（A）、烟雾暴露组（S）、罗红霉素组（R）。哮喘组和烟雾暴露组第1天和第14天小鼠腹腔内注射0.2 ml OVA/Al（OH）3混合液[其中OVA 0.1 mg，Al（OH）3 1 mg]致敏；第21天开始雾化吸入1%OVA的生理盐水 8 mL激发，每次30 min，共18 d。烟雾暴露组从1%OVA雾化激发开始，每日于雾化激发后，参照文献[4]自制半封闭小鼠吸烟箱，每次点燃2支香烟燃烧8 min，休息5 min后再点燃2支，共10支，1次/d，共18 d。罗红霉素组在烟雾暴露组的基础上每次激发前半小时予以罗红霉素40 mg/kg灌胃。对照组用等量生理盐水代替OVA激发和罗红霉素灌胃，最后一次激发后处死，取支气管肺泡灌洗液（BALF）及肺组织标本备用。

1.2.2 各组小鼠肺组织病理超微结构的变化 石蜡切片HE染色后光镜下观察各组肺组织结构，支气管及血管周围炎症浸润情况，有无上皮损伤。

1.2.3 BALF中细胞分类计数 BALF沉渣用1 mLPBS液重悬，取一滴滴于载玻片上涂片，自然晾干后加瑞氏液固定，再加等量缓冲液与染料混匀，染色5～10 min，冲去染液。选择涂片体尾交界处染色良好的区域，在高倍镜下，按一定顺序移动视野，根据形态特征对200个白细胞做细胞分类检测。

1.2.4 Western blot检测HDAC2蛋白表达 将各组小鼠肺组织用适量蛋白裂解液裂解，提取总蛋白，用BCA法进行蛋白定量。蛋白变性后， 按每孔40 μg蛋白量加样进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，PVDF 转膜。一抗用兔抗小鼠HDAC2（1﹕600），二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔（1﹕5000），室温孵育1～2 h，洗膜，ECL显影。采用Band Scan电泳图像分析软件，以GAPDH蛋白为内参，以目的蛋白和内参的吸光度的比值代表目的蛋白的相对含量，进行半定量分析。

1.2.5 统计学方法 全部数据经SPSS 19.0统计软件进行分析，所有数据进行正态性检验，数据以均数±标准差（x±s）表示。多组样本均数比较进行方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差不齐者用 Dunnett T3 检验，方差齐者用Tukey检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织显微结构变化

肺组织切片HE染色后，光镜下可见C组小鼠肺组织结构完整，支气管及血管周围未见明显炎症细胞浸润。A组小鼠肺组织内支气管壁各层黏膜皱褶增多，支气管上皮断裂、脱落及较多的炎性细胞浸润。S组肺泡腔不规则扩大，肺泡间隔断裂或者变薄，气道壁明显增厚，支气管平滑肌肥大，大量淋巴细胞及中性粒细胞浸润。R组少量炎性细胞浸润，支气管壁轻度增厚，跟S组相比，炎症症状明显减轻，见图1。

2.2 各组小鼠BALF细胞计数及分类

由表1可见，哮喘组以嗜酸性粒细胞升高为主，而烟雾暴露组则以中性粒细胞升高为主，烟雾暴露组中性粒细胞计数比例明显高于哮喘组（P<0.01），哮喘组和烟雾暴露组与对照组相比中嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞计数比例均升高（均P<0.01），罗红霉素组与烟雾暴露组相比嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞明显下降（P<0.05或P<0.01）。