原花青素通过内质网应对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用

王鑫++++++王巍++++++张君丞++++++贾大林

[摘要] 目的 觀察原花青素（PCs）通过抑制内质网应激对H9C2心肌细胞缺氧/复氧（H/R）后损伤的保护作用。方法 将培养的H9C2心肌细胞随机分为5组：对照组、缺氧/复氧组（H/R组）、低剂量PCs+H/R组（LPCs组）、中剂量PCs+缺氧复氧组（MPCs组）、高剂量PCs+缺氧复氧组（HPCs组）。对照组心肌细胞正常培养至实验结束，H/R组行缺氧3 h后复氧3 h，PCs组分别于缺氧前30 min给予50、100、200 μg/mL 的PCs培养再行缺氧/复氧过程。实验后MTT法测定细胞生存率；测定乳酸脱氢酶（LDH）活性；流式细胞术检测心肌细胞凋亡；Western blot测定内质网应激蛋白葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、CCAAT/增强子结合蛋白（CHOP）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）、Caspase-12的表达。结果 与对照组比较，H/R组细胞生存率显著降低（P < 0.05），LDH活性和细胞凋亡率显著升高（P < 0.05）；H/R组GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12蛋白表达较对照组明显增加（P < 0.05）；给予不同浓度PCs干预后，PCs预处理组细胞生存率较H/R组明显升高（LPCs组除外），LDH活性和细胞凋亡率明显降低（P < 0.05），PCs预处理组GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12蛋白表达较H/R组明显下降（P < 0.05），中高剂量PCs抑制作用较低剂量强（P < 0.05）。结论 H/R可诱导心肌细胞内质网应激，引起细胞损伤和凋亡；PCs可以通过抑制内质网应激发挥其保护作用，减少细胞损伤和凋亡。

[关键词] 原花青素；H9C2心肌细胞；缺氧/复氧；内质网应激

[中图分类号] R542 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）11（b）-0029-05

[Abstract] Objective To observe the protective effect of proanthocyanidins （PCs） on hypoxia/reoxygenation （H/R） injury by attenuating endoplasmic reticulum stress （ERS） in H9C2 cardiomyocytes. Methods The H9C2 cardiomyocytes were randomly divided into five groups： control group， hypoxia/reoxygenation group （H/R group）， low-dose PCs+H/R group （LPCs group）， middle-dose PCs+H/R group （MPCs group）， high-dose PCs+H/R group （HPCs group）. H9C2 cardiomyocytes of control group were cultured under normal condition till the end of experiment. Cardiomyocytes of H/R group underwent hypoxia for 3 hours followed by reoxygenation for 3 hours. Different doses of PCs （50， 100， 200 μg/mL） were given 30 minutes before hypoxia in the PCs groups. Cell viability by MTT， lactic dehydrogenase （LDH） activity， cell apoptosis ratio by flow cytometric measurement and the protein expression of glucose-regulated proteins 78 （GRP78）， C/EBP-homologous protein（CHOP）， phosphorylation of c-Jun-N-terminal protein kinase（p-JNK） and Caspase-12 were detected. Results Compared with the control group， cell viability decreased significantly and LDH activity and apoptosis ratio increased significantly in the H/R group （P<0.05）， coupled with obvious increased expression of GRP78， CHOP， p-JNK， Caspase-12 protein （P < 0.05）. Different doses of PCs pretreatment increased cell viability （except the LPCs group）， decreased LDH activity and apoptosis ratio （P < 0.05） as well as decreased expression of GRP78， CHOP， p-JNK， Caspase-12 protein compared to the H/R group （P < 0.05）. Middle and high dose PCs pretreatment showed more effect than low dose group. Conclusion H/R can induce ERS leading to cell injury and apoptosis. PCs can protect cardiomyocytes against H/R injury by inhibiting ERS.

[Key words] Proanthocyanidins； H9C2 cardiomyocytes； Hypoxia/reoxygenation； Endoplasmic reticulum stress

缺血/再灌注损伤会引起组织功能紊乱甚至细胞凋亡[1-2]，如何有效预防心肌缺血/再灌注损伤是近年来冠心病治疗的热点问题[3]。越来越多的研究表明，内质网应激（ERS）在缺血/再灌注损伤的病理过程中起重要作用[4]。早期ERS可通过调节蛋白合成促进细胞修复，而持续的ERS则会激活内质网相关凋亡通路：CHOP、JNK、Caspase-12，引起细胞凋亡[5]。原花青素（PCs）是从植物中提取的一类具有多种生物活性的多酚类化合物，已被证实对心肌缺血/再灌注损伤有保护作用[6]，但PCs是否通过抑制ERS来减轻再灌注损伤及细胞凋亡未有文献报道。本实验采用H9C2心肌细胞建立缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型，模拟心肌缺血/再灌注损伤，在细胞水平观察PCs对心肌细胞H/R损伤的保护作用，同时检测ERS凋亡通路相关蛋白的表达变化，为保护心肌缺血/再灌注损伤提供药物防治理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株与药物

H9C2心肌细胞株（购自中科院上海细胞库），PCs（购自上海Aladdin科技公司，纯度≥95%）。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM培养基（Gibco），胎牛血清（Hyclone），PBS缓冲液（双螺旋），胰蛋白酶（碧云天），MTT试剂盒（Sigma），细胞凋亡检测试剂盒、GRP78、CHOP、p-JNK抗体（沈阳万类生物公司），Caspase-12抗体（Santa Cruze CA，USA），乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒（南京建成公司），CO2培养箱（HF-90），流式细胞仪（C6，美国BD公司），凝胶成像系统（WD-9413B，北京六一公司），双垂直蛋白电泳仪（DYCZ-24DN），酶标仪（ELX-800）等。

1.3 实验分组

将实验用H9C2心肌细胞分为5组，①对照组：心肌细胞于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在95%空气+5%CO2的37℃培养箱内正常培养6 h；②H/R组：将心肌细胞置换到无糖无血清、缺氧的DMEM培养基（氮气预缺氧处理10 min），置于37℃充满95%N2和5%CO2的三气培养箱内培养3 h，然后更换为正常培养基，置于95%空气+5%CO2的37℃培养箱复氧培养3 h。③④⑤不同浓度PCs预处理组：分别加入50 μg/mL（LPCs组）、100 μg/mL（MPCs组）、200 μg/mL（HPCs组）PCs对心肌细胞预处理30 min，后行H/R（同H/R组）。

1.4 MTT法检测细胞存活率

将H9C2组细胞培养至密度为90%左右，进行细胞计数，按实验分组接种于96孔培养板中，每孔的细胞个数为5×103个，每组设计5个复孔，接种后置于37℃、5%CO2培养箱中分别培养24 h。每个实验组按照上述方法分别处理后加入5 mg/mL的MTT，置于37℃培养箱中孵育4 h，小心吸去上清，加入200 μL DMSO以溶解细胞形成的紫色結晶，在酶标仪上测定其在490 nm处OD值，进行数据分析。存活率（%）=实验组OD/对照组OD×100%，重复测定5次。

1.5 LDH测定

将LDH试剂盒中NaOH与丙酮酸稀释10倍，分别配制为0.4 mol/L NaOH溶液与0.2 μmol/mL丙酮酸标准液；取各组细胞上清液为待测样品，与试剂盒中适量的底物缓冲液、辅酶及0.2 μmol/mL丙酮酸标准液、蒸馏水混匀，37℃水浴15 min；加入适量2，4-二硝基苯肼混匀，37℃水浴15 min；加入适量0.4 mol/L NaOH溶液混匀，室温放置5 min，在酶标仪上测定其在450 nm处的OD值，进行数据分析。

1.6 流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡率

细胞按不同分组要求处理后，收集细胞，去上清，用PBS缓冲液洗涤细胞两次，再离心去上清，每管细胞样品中加入500 μL Binding Buffer轻轻重悬细胞，后加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL Propidium Iodide混匀，室温避光孵育15 min，随即进行流式检测。

1.7 Western blot检测

收集细胞提取蛋白，通过BCA反应测定蛋白浓度。取样本蛋白40 μg，以8%～13%聚丙烯酰胺凝胶（SDS）电泳分离蛋白，转印、封闭后，依次加入一抗（羊抗兔GRP78抗体1∶500，羊抗兔CHOP抗体1∶500，羊抗兔p-JNK抗体1∶500，羊抗兔Caspase-12抗体1∶1000）4℃孵育过夜，加入二抗37℃孵育45 min，加入ECL发光液静置5 min，用凝胶图象处理系统（Gel-Pro-Analyzer软件）分析目标条带的光密度值。β-actin为内参照。

1.8 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析，计量资料用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用LSD法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCs预处理提高H/R损伤后心肌细胞存活率，减少心肌细胞LDH释放

与对照组比较，H/R组细胞存活率明显降低（P < 0.05），LDH活性明显升高（P < 0.05）。与H/R组相比，MPCs、HPCs组心肌细胞存活率显著提高（P < 0.05），LPCs组改善作用不明显（P > 0.05），其中MPCs组细胞存活率提高最多。不同浓度PCs预处理组的LDH活性明显低于H/R组（P < 0.05）。见表1。

2.2 PCs預处理可减少H/R后心肌细胞凋亡

对照组细胞凋亡极少，而H/R组出现大量凋亡和坏死细胞，与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。与H/R组比较，不同浓度PCs预处理后细胞凋亡及坏死均明显减少（P < 0.05），MPCs组细胞凋亡减少最明显。见图1。

2.3 PCs预处理对心肌细胞ERS相关蛋白表达的影响

H/R组GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12蛋白表达水平较对照组明显升高（P < 0.05）；给予不同浓度PCs干预后，GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12蛋白表达水平下降（P < 0.05），MPCs、HPCs组GRP78、CHOP、p-JNK蛋白表达低于LPCs组，HPCs组Caspase-12蛋白表达低于LPCs组（P < 0.05）。见图2。

3 讨论

本研究主要发现PCs可以通过减轻内质网应激发挥对H/R心肌细胞的显著保护作用，这种作用非剂量依赖性，本研究PCs最佳保护浓度测定为100 μg/mL。

PCs是植物中广泛存在的一类多酚类化合物，由儿茶素或表儿茶素形成的二聚体或多聚体。在众多植物中，葡萄籽提取物中的PCs的含量最高。PCs是强效的天然抗氧化物，其清除氧自由基的能力远超过维生素C、维生素E或β胡萝卜素[7]。PCs具有众多生物活性，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、保护心血管作用等[8-11]。PCs可以通过清除氧自由基和减轻线粒体凋亡通路减轻心肌缺血/再灌注损伤[12-13]，但目前尚未报道证实PCs通过抑制内质网应激介导的凋亡通路保护H/R心肌细胞。

ERS指的是在各种不良刺激下内质网稳态被破坏、功能发生紊乱，使大量错误折叠、未折叠蛋白在内质网腔内累积及钙平衡紊乱的过程[14]。GRP78是内质网分子伴侣蛋白，其表达上调是内质网应激激活的标志[15]。早期内质网应激时，GRP78结合未折叠或错误折叠蛋白，通过减少蛋白合成、增加促进蛋白正确折叠的分子伴侣的表达和内质网相关降解来减轻ERS并促进细胞恢复[16]。如果应激严重或持续存在，则会诱导ERS相关性细胞凋亡，造成组织细胞损伤，主要包括CHOP、JNK和Caspase-12凋亡通路的激活[17]。

本研究中，H/R组的心肌细胞存活率明显降低，LDH活性和细胞凋亡率明显升高，GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12蛋白表达明显上调，均说明H/R对心肌细胞造成明显损伤并激活了ERS及其凋亡通路。PCs预处理显著提高了心肌细胞存活率，减少了LDH释放和细胞凋亡，下调了ERS相关蛋白表达，说明PCs对H/R心肌细胞有明显的保护作用。

本研究结果显示，100 μg/mL剂量PCs保护作用优于50、200 μg/mL剂量组，说明这种保护作用不随浓度增加而增强。法国科学院曾报告PCs抗氧化活性在一定浓度内呈现剂量依赖性，但如果超出一定浓度，其抗氧化活性随浓度升高而降低[18]。余莹等[19]发现，PCs清除羟基自由基的能力在10 g/L以内随浓度增加几乎呈直线上升，超过20 g/L后不再增加。另一方面，刘畅等[20]观察PCs对脑缺血影响中报道，50～200 mg/（kg·d）的PCs呈剂量依赖性减少大鼠脑缺血后自由基生成；何佳声等[21]研究PCs对人结肠癌细胞增殖和凋亡的影响中发现，20～80 μg/mL的PCs呈剂量依赖性抑制结肠癌细胞增殖并促凋亡，与本文研究结果不一致，考虑本研究中高剂量组PCs浓度已超过PCs对心肌细胞的最佳保护浓度，故保护作用呈降低趋势。目前PCs对心肌缺血/再灌注损伤研究中未见浓度研究的报道。

本文从细胞水平证实了PCs预处理可通过抑制ERS减少H/R引起的细胞损伤和凋亡，为缺血再灌注损伤的药物预防提供了理论基础。本文不足之处在于H9C2心肌细胞无自发性收缩，不能充分模拟人类心肌细胞条件，有待于动物实验进一步证实实验结果。

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