HPLC法测定延丹胶囊中原儿茶醛、芍药苷和橙皮苷的含量

王玉龙，袁步娟，赵海欣，刘　云

[作者单位]　224001 江苏 盐城，盐城市中医院(王玉龙)，224002 江苏 盐城，盐城市药品检验所(袁步娟)，224001 江苏 建湖县，建湖县人民医院药学部(赵海欣)，224002 江苏 盐城，盐城市师范学院药学院(刘云)



HPLC法测定延丹胶囊中原儿茶醛、芍药苷和橙皮苷的含量

王玉龙，袁步娟，赵海欣，刘云

[作者单位]224001 江苏 盐城，盐城市中医院(王玉龙)，224002 江苏 盐城，盐城市药品检验所(袁步娟)，224001 江苏 建湖县，建湖县人民医院药学部(赵海欣)，224002 江苏 盐城，盐城市师范学院药学院(刘云)

[摘要]目的建立控制延丹胶囊质量的方法。方法采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)法同时测定延丹胶囊中原儿茶醛、芍药苷和橙皮苷的含量，Waters CAPCELL PAK C18色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)，流动相为乙腈-0.1%磷酸，检验波长230nm，柱温25℃。结果原儿茶醛、芍药苷和橙皮苷分别在0.007728～0.4508 μg(相关系数r=1.0000)、0.06462～4.308 μg(r=1.0000)和0.06984～3.492 μg(r=0.9999)呈良好线性关系；平均回收率(n=6)为99.00%[相对标准偏差(RSD)为1.10%]、98.92%(RSD为1.10%)，98.65%(RSD为1.10%)。结论该方法简便、准确、重复性好，可作为延丹胶囊质量控制方法。

[关键词]高效液相色谱法；原儿茶醛；芍药苷；橙皮苷；含量测定

延丹胶囊主要成分是丹参、延胡索(醋制)、五灵脂、瓜蒌、乳香(醋制)、白芍、枳壳、柴胡[1]，主要用于冠心病劳累性心绞痛气滞血瘀证：如胸痛、胸闷、心慌、憋气等[2]，并可改善心电图，增加体力[3]。延丹胶囊在国家食品药品监督管理局国家药品标准YBZ04452005-2009Z中收载[4]，目前已有的延丹胶囊的质量控制标准主要是芍药苷、橙皮苷、延胡索乙素、原儿茶醛的薄层鉴别，而丹参酮ⅡA的含量测定仅以薄层色谱法的定性鉴别和丹参酮ⅡA含量为指标的测定，此方法很难有效的反映此制剂的质量[5]。同时测定延丹胶囊中原儿茶醛、芍药苷和橙皮苷含量的研究罕见报道[6]。本文拟将采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)法同时测定延丹胶囊中原儿茶醛、芍药苷和橙皮苷含量。

1资料与方法

1.1仪器与试药HPLC系统：高效液相色谱仪(Waters 2695/2489 日本岛津公司)；XS205电子分析天平(0.1 mg，梅特勒托利多公司)；MP2001电子天平(Sartorius 0.1 g，上海恒平科学仪器有限公司)；B3200S-T超声波清洗器(比能信超声(上海)有限公司)；紫外-可见分光光度计(UV2501日本岛津)。甲醇(色谱纯，江苏汉邦科技有限公司)；纯净水；乙醇(分析纯，国药集团化学制剂有限公司)；氨水(临淄环宇经贸有限公司)；芍药苷(含量：94.9%，中国药品生物制品检定所提供，批号：110736-201337)；原儿茶醛(含量：96.5%，中国药品生物制品检定所提供，批号：110810-200506)；橙皮苷(含量：95.1%，中国药品生物制品检定所提供，批号：110721-201014)；延丹胶囊(由安徽省天康药业有限公司提供，批号：121205-130421-131219)。

1.2溶液制备

1.2.1对照品溶液:①精密称取对照品橙皮苷、芍药苷、原儿茶醛适量，置10 ml量瓶中，首先加适量甲醇超声溶解，然后用甲醇定容至刻度，摇匀，配得浓度分别为1164.0、1077.0、128.8 μg/ml的对照储备液。②精密量取储备液各1.0 ml于10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度分别为116.40、107.70、12.88 μg/ml的橙皮苷、芍药苷和原儿茶醛对照品混合溶液。

1.2.2供试品溶液:精密称取延丹胶囊3.0016 g，置锥形瓶中，加入100%甲醇50 ml，称定重量，超声45 min后，用100%甲醇补重，过滤，得供试品溶液。

1.2.3色谱条件:色谱柱：Waters CAPCELL PAK C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温：25℃，乙腈-0.1%磷酸为流动相，进样量：10 μl，检测波长：230 nm，流速：1.0 ml/min，分析时间：24 min，延长8 min。

2结果

2.1波长的选择取“1.2.1”下的橙皮苷、芍药苷、原儿茶醛对照品溶液分别于紫外可见分光光度计下200～400 nm波长范围内扫描，结果显示分别在283、230、231 nm处有最大吸收。既往研究[7-12]测定三者的含量大多使用230 nm和280 nm的波长。取对照品溶液适量(0.45 μm)薄膜过滤，在高效液相双波长进行检测得到的图谱显示230 nm的色谱图基线更稳、干扰少，故选230 nm作为检测波长。

2.2流动相的选择本文考察了甲醇-水系统和甲醇-酸系统作为流动相，结果表明，以甲醇-酸溶液为流动相，所得色谱峰峰形好，分离效果佳。同时比较了相同pH的甲酸、冰醋酸和磷酸，结果显示加入磷酸的效果比较好，故选择甲醇-0.1%磷酸系统作为流动相。

2.3提取工艺的考察以橙皮苷、芍药苷、原儿茶醛的含量为指标，考察提取工艺。采用超声法分别考察了甲醇、乙醇的提取效率，结果表明甲醇的提取效率较高。采用超声法分别考察了体积分数为50%、75%、100%的甲醇、以及100%甲醇加1 ml氨水的提取效率，结果表明体积分数为100%甲醇加1 ml氨水的提取效率最高。同时考察超30 min、45 min和1 h的提取效果，结果表明超声45 min和1 h效果相近，故选择100%甲醇加1 ml氨水超声45 min，提取1次。

2.4样品的处理方式考察了未使用0.45 μm薄膜过滤和使用薄膜过滤的样品，发现过滤过的样品所得色谱峰峰形好，分离效果佳，杂峰较少。

2.5专属性分析在“1.2.3”色谱条件下取“1.2.1”下混合对照品溶液(图1)和“1.2.2”下供试品溶液(图2)适量(0.45 μm微孔滤膜过滤后进样)。从图可见色谱峰相互无干扰，表明该方法有较强的专属性，经计算得原儿茶醛理论塔板数为16274，芍药苷理论塔板数为32027，橙皮苷理论塔板数为56089。

2.6线性关系考察取“1.2.1”项下对照品储备液适量(0.45 μm微孔滤膜过滤)，在“1.2.3”项色谱条件下进样10、15、35 μl的系列对照品溶液。再取其1 ml到10 ml容量瓶中加甲醇，定容至刻度摇匀后取适量(0.45 μm微孔滤膜过滤)，进样6、8、10 μl的系列对照品溶液，按上述色谱条件进样测定峰面积，分析数据见表1。以峰面积y对进样量x(μg)绘制标准曲线，结果表明：原儿茶醛、芍药苷和橙皮苷的线性范围分别为0.007728~0.4508 μg范围内，回归方程为：y=2.3E+6x+22359，r=1.0000；0.06462~4.308 μg范围内，回归方程为：y=1.4E+6x-144.76，r=1.0000；0.06984~3.492 μg范围内，回归方程为：y=5.7e+6x+5511.9，r=0.9999，与峰面积呈良好线性关系。

2.7精密度试验日内精密度：在24 h内，取供试品溶液适量0.45 μm薄膜过滤，在“1.2.3”项色谱条件下连续进样6次，每次10 μl，记录色谱峰面积。结果表明：橙皮苷、芍药苷、原儿茶醛峰面积的RSD(n=6)分别为0.63%、0.79%、0.71%，表明该方法在探索的色谱条件下可行。

2.8检测限及定量限测定将各对照品色谱峰的信号与基线信号进行比较，以信噪比约为3∶1时注入仪器的量确定为检测限。以信噪比约为10:1时注入仪器的量确定为定量限。结果表明：原儿茶醛的检测限为38.64 μg，定量限为128.80 μg；芍药苷的检测限为107.70 μg，定量限为430.80 μg；橙皮苷的检测限为23.28 μg ，定量限为174.60 μg。

图1　混合对照品图谱

表1　对照品的线性关系(n=6)

图2　供试品延丹胶囊样品图谱

2.9稳定性试验取“1.2.2”下的供试品溶液适量，分别在0、2、4、8、16、24 h，按“1.2.3”项色谱条件进样测定，结果显示橙皮苷、原儿茶醛、芍药苷峰面积的RSD分别为1.78%、1.72%、0.93%，说明供试品溶液在24 h内稳定。

2.10重复性试验精密量取1号样品6份，每份10片量，按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“1.2.3”色谱条件下进行分析测定。结果表明：橙皮苷含量的平均值(n=6)为409.80 μg/ml，RSD为1.62%；原儿茶醛含量的平均值(n=6)为77.01 μg/ml，RSD为1.63%；芍药苷含量的平均值(n=6)为9.12 μg/ml，RSD为0.86%。

2.11回收率试验精密称取已知含量的延丹胶囊1.5 g共6份，置于具塞瓶中，精密加入原儿茶醛对照品溶液(0.2248 mg/ml)1.0 ml，橙皮苷对照品溶液(0.0613 mg/ml)1.0 ml，芍药苷对照品溶液(0.1105 mg/ml)1.0 ml，加100%甲醇50 ml，称定重量，超声45 min，放冷，加100%甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液，滤过，即得加样回收试验的供试品溶液。依法测定并计算回收率，结果见表2、3、4。

表2　原儿茶醛回收率(n=6)

表3　橙皮苷回收率(n=6)

表4　芍药苷回收率(n=6)

2.12取样测定分别取本批号的延丹胶囊3份，按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液。取适量用0.45 μm薄膜过滤，精密吸取供试品溶液10 μl，在上述色谱条件下进样分析，测定峰面积，用外标法计算出各成分的含量，测定结果见表5。

表5　延丹胶囊中各成分的含量(n=3)

3讨论

中药复方胶囊是由多种化学成分共同作用而发挥药效，单一成分含量的高低不能全面反映中药复方胶囊的药效。延丹胶囊主要是由丹参和白芍制成，故将其中的橙皮苷、芍药苷和原儿茶醛作为含量考察指标之一，用HPLC法测定其含量以进行本品的质量控制。

根据有关文献报道[13-15]，芍药苷的最大吸收波长为230 nm，橙皮苷有两个最大吸收波长，分别为230 nm和284 nm，因芍药苷在284 nm附近紫外吸收较低，故本实验选用230 nm作为检测波长，同时测定芍药苷和橙皮苷两种组分的含量。

丹参水溶性成分主要是酚酸类化合物，在中性流动相中易发生离解，使含量偏低且拖尾严重。因此，一般情况下，HPLC法测定药材或制剂中原儿茶醛的含量多采用甲醇-冰醋酸-水系统，在流动相中加入少量冰醋酸或磷酸，抑制其解离并改善峰形和分离度，能够满足多数样品的分离要求，故本研究选用甲醇-磷酸作为流动相。

综上所述，采用高效液相法同时测定延丹胶囊中橙皮苷、芍药苷和原儿茶醛的含量，用以延丹胶囊的质量控制，可全面的反映本制剂中多组分药材的质量，且方法简便、可靠、分离效果与重复性好，可为本品的质量标准提供借鉴。

[参考文献]

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(2010年版)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:229.

[2]杨志霞,林谦,马利.丹参对心血管疾病药理作用的文献研究[J].世界中西医结合杂志,2012,7(2):93-96.

[3]郑世存,李晓宇,欧阳兵,等.芍药苷药理作用研究新进展[J].中国药物警戒,2012,9(2):100-103.

[4]国家食品药品监督管理局.国家食品药品监督管理局国家药品标准(新药试行标准转正式标准)颁布件(中药)[J].中国药品标准,2009,10(6):472-475.

[5]何昱,成金乐,徐吉银,等.HPLC-DAD同时测定丹参中原儿茶醛、丹酚酸、隐丹参酮、丹参酮ⅡA四种成分的含量[J].中国中药杂志,2011,13(4):688-692.

[6]秦卫红,王响群,秦迎春,等.HPLC法同时测定中药多种有效成分含量的应用[J].中国医药指南,2013,11(5):439-440.

[7]张婷.HPLC法同时测定胃气痛片中芍药苷与橙皮苷的含量[J].安徽医药,2014,18(11):2077-2079.

[8]张琳琳,祁峰,卞海林,等.HPLC法测定通气合剂中芍药苷和橙皮苷的含量[J].现代中西医结合杂志,2012,21(36):4092-4093.

[9]Xuegang Z, Shuxin C, Donghua W,etal. Determination of Paeoniflorin and Albiflorin Contents in Different Germplasms and Parts of Paeonia lactiflora Pall[J].Medicinal Plant, 2013,4(4):784-788.

[10]李妍,杨燕云,张振秋,等.HPLC法同时测定白芍、甘草药对提取物中9种有效成分[J]. 中成药,2013,35(1):100-104.

[11]魏桂芳,王汉平,杨志灵,等.HPLC法测定丹参中原儿茶醛的含量[J].陕西中医,2010,31(8):1060-1061.

[12]吴锋,鲁建丽,豆久锋,等.HPLC法同时测定心可舒丸中丹参素、原儿茶醛及葛根素[J].中草药,2012,43(9):1770-1772.

[13]张维,张志云,礼彤,等.HPLC法同时测定冠脉康片中橙皮苷和芍药苷的含量[J].辽宁中医药大学学报,2013,15(8):53-55.

[14]邹薇.RP-HPLC法测定补阳还五苷酮胶囊中芍药苷的含量[J].安徽医药,2012,16(5):614-616.

[15]王冬.HPLC法测定甲状腺颗粒中芍药苷和橙皮苷含量[J].天津医科大学学报,2012,18(1):128-130.

(收稿时间：2015-09-15修回时间：2015-10-18)

·论著·

HPLC Method in Detection of Contents of Protocatechuic Aldehyde, Paeoniflorin and Hesperidins in Yandan Capsules

WANG Yu-long1, YUAN Bu-juan2, ZHAO Hai-xin3, LIU Yun4(1. Traditional Chinese Medical Hospital of Yanchen, Yancheng, Jiangsu 224001, China; 2. Drug Inspection Institute of Yancheng, Yancheng, Jiangsu 224002, China; 3. Department of Pharmacy, the People's Hospital of Jianhu County, Jianhu, Jiangsu 224700, China; 4. Pharmaceutical College, Yancheng Teachers University, Yancheng, Jiangsu 224002, China)

[Abstract]ObjectiveTo establish a method to control the quality of Yandan capsules. MethodsThe high-performance liquid chromatography (HPLC) method and a CAPCELL PAK C18 (150 mm×4.6 mm， 5 μm) chromatographic column were used; acetonitrile and 0.1 % phosphoric acid solution were used as mobile phase in gradient mode. The wavelength was 30 nm with 25℃ column temperature. ResultsThe Protocatechuic Aldehyde, Paeoniflorin and Hesperidin showed good linear correlation in the ranges of 0.007728-0.4508 μg [correlation coefficient (r) =1.0000], 0.06462-4.308 μg (r=1.0000) and 0.06984-3.492 μg (r=0.9999 ) respectively, and the average recovery rates were 99.00 % [the relative standard deviation (RSD)∶1.10 %], 98.92 % (RSD∶1.10 %) and 98.65% (RSD∶1.10 %) respectively. ConclusionThe method is simple and feasible with good repeatability, and it can be used for the quality control of Yandan capsules.

[Key words]High performance liquid chromatography; Protocatechuic aldehyde; Paeoniflorin; Hesperidin; Assay

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.12.023

[文献标志码][中国图书资料分类号]R446A

[文章编号]2095-140X(2015)12-0099-04