氮氧自由基与γ-氨基丁酸偶联物的设计合成与抗缺氧活性研究



氮氧自由基与γ-氨基丁酸偶联物的设计合成与抗缺氧活性研究

景临林，马慧萍，樊鹏程，何蕾，贾正平

[摘要]目的设计合成一种新型氮氧自由基与γ-氨基丁酸偶联物并研究其抗缺氧活性。方法以对羟基苯甲醛、溴乙酸乙酯、γ-氨基丁酸甲酯盐酸盐和2,3-二甲基-2,3-二羟氨基丁烷为原料，经醚化、酰胺化、缩合和氧化反应得到一种氮氧自由基与γ-氨基丁酸的偶联物(化合物3)，并通过小鼠常压密闭耐缺氧实验对其抗缺氧活性进行评价。结果3组在常压密闭缺氧实验下，与缺氧模型组比较，乙酰唑胺组和化合物3组存活时间均明显延长，差异有统计学意义(P<0.01)，化合物3组与乙酰唑胺组比较存活时间延长(P<0.01)。与正常对照组比较，缺氧模型组中LD含量显著升高(P<0.01)，LDH活性显著降低(P<0.01)；与缺氧模型组比较，化合物3组小鼠血浆中LD含量差异无统计学意义，但是LD累积速率明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。结论氮氧自由基与γ-氨基丁酸偶联物的设计路线合理，合成方法简便，产率较高，并且表现出了较高的抗缺氧活性。

[关键词]氮氧自由基；γ-氨基丁酸；设计合成；抗缺氧活性

氮氧自由基(nitronyl nitroxide， NN)是分子结构含未成对自旋单电子的一类稳定的自由基，最初主要作为自旋示踪剂来说明细胞膜结构和功能[1]。NN是一种特殊的自由基清除剂，通过电子得失和氧化态与还原态之间转换，能够以催化的方式大量清除活性氧(ROS)[2]，近年来研究发现，NN具有抗缺血再灌注损伤[3]、抗肿瘤[4]、抗病毒[5]、防辐射[6]和神经保护[7]等众多生物活性。课题组近期研究还发现，NN对高原缺氧小鼠具有良好的保护作用[8]。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，可以通过拮抗谷氨酸的兴奋性毒性，减轻动物脑缺血时对细胞损伤，有显著的神经保护作用[9]。有研究发现：GABA能够减少小鼠耗氧量，延长常压密闭缺氧小鼠的存活时间，明显提高小鼠的缺氧耐受性[10]。

为了获得抗缺氧活性更加优异的化合物，本文根据药物拼合原理，以对羟基苯甲醛、溴乙酸乙酯、γ-氨基丁酸甲酯盐酸盐和2,3-二甲基-2,3-二羟氨基丁烷为原料，将具有抗缺氧活性的γ-氨基丁酸与氮氧自由基分子通过酰胺键连接，合成了一种新型氮氧自由基与GABA偶联物，产物结构经IR、EPR、EI-MS和元素分析确认，并观察其抗缺氧活性。

1材料与方法

1.1药品与试剂γ-氨基丁酸甲酯盐酸盐、N-甲基吗啉和溴乙酸乙酯(阿拉丁试剂公司)；对羟基苯甲醛(南京多博化工有限公司)；GF254高效板和柱层析硅胶(青岛海洋化工厂分厂)；乙酰唑胺(武汉远城科技发展有限公司，批号100114，纯度>99%)；乳酸(LD)测试盒和乳酸脱氢酶(LDH)测试盒(南京建成生物工程研究所)；其他均为市售分析纯试剂。无水的溶剂经除水处理。

1.2实验动物清洁级BABL/C雄性小鼠24只，体重18～22 g，由兰州军区兰州总医院动物实验科提供，许可证号：SYXK(军)2014-0029。

1.3实验仪器DHJF-2005低温反应器(郑州长城科工贸有限公司)；NEXUS 670红外光谱仪(KBr压片，美国Thermo Nicolet公司)；Bruker AVANCE III 400核磁共振波谱仪(瑞士Brucker公司，以CDCl3或者DMSO-d6为溶剂，TMS为内标，美国Sigma公司)；Vario EL cube型元素分析仪(德国Elementar公司)；LCMS-API 3200质谱仪(美国Applied Biosystems公司)；ER200DSRC10/12电子顺磁共振波谱仪(瑞士Brucker公司)。

1.4实验方法

1.4.12,3-二甲基-2,3-二羟氨基丁烷按照文献[11]方法制备：合成路线见图1。

图1　2,3-二甲基-2,3-二羟氨基丁烷的合成路线

1.4.22-(4-甲酰基苯氧基)乙酸(化合物1)：将1.22 g(10 mmol)对羟基苯甲醛、2.07 g(15 mmol)K2CO3悬浮于100 ml无水丙酮中，搅拌下滴加溴乙酸乙酯3.2 ml。滴毕后升温至60℃，继续反应6 h，TLC检测反应，反应结束后，过滤，减压除去丙酮，残余物溶于50 ml甲醇中，冷却至0℃，加入1.5 g KOH，继续搅拌1 h，减压除去甲醇，残余物溶于50 ml水中，用2 mol/L盐酸调节pH=6，此时有大量白色固体析出，过滤，滤饼用冰水洗涤数次，真空干燥后的目标化合物1。

1.4.34-(2-(4-甲酰基苯氧基)乙酰氨基)丁酸甲酯(化合物2)：将化合物1(0.91 g，5 mmol)和4-氨基丁酸甲酯盐酸盐(0.92 g，6 mmol)溶于50 ml无水四氢呋喃中，冷却至0℃，用N-甲基吗啉调节pH=9。缓慢滴加溶于20 ml无水THF的DCC(1.22 g，6 mmol)，滴毕后0℃继续搅拌2 h，然后升至室温继续反应16 h，TLC监测反应完全后，过滤，减压除去溶剂后快速柱层析分离，得目标化合物2。

1.4.42-(4-(2-((4-甲氧基-4-丁甲酰基)氨基)-2-氧代乙氧基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-咪唑啉-3-氧-1-氧基自由基(化合物3)：将化合物2(1.39 g，5 mmol)和0.74 g(5.0 mmol)2,3-二甲基-2,3-二羟氨基丁烷溶于25 ml甲醇中，回流反应12~15 h。减压除去甲醇，残余物悬浮于25.0 ml CH2Cl2中，低温反应器冷却至0℃，加入15.0 ml NaIO4(0.85 g)水溶液，剧烈搅拌15 min后停止反应。静置分层后，水相用CH2Cl2萃取两次，合并有机相，无水Na2SO4干燥过夜，过滤，减压除去溶剂，快速柱层析分离，得蓝色油状物，为目标化合物3。合成线路见图2。

图2　氮氧自由基与γ-氨基丁酸偶联物的合成路线

1.4.5常压密闭缺氧实验：取清洁级BABL/C雄性小鼠24只，随机分成4组，每组6只。分为正常对照组、缺氧组、乙酰唑胺组和化合物3组。正常对照组不给药，不缺氧；缺氧组腹腔注射(ip)等容积生理盐水加上适量Tween 80；乙酰唑胺组ip乙酰唑胺200 mg/kg；化合物3组ip化合物3为200 mg/kg。给药 30 min后，除正常组外，将其余3组小鼠放入250 ml广口瓶(瓶内放碱石灰15 g以吸收CO2和H2O，垫滤纸以吸收尿液，广口瓶用前均盛水校正容量)中，每瓶1只小鼠，加盖密封，以呼吸停止为指征，记录小鼠的存活时间。小鼠死亡后即刻取出，从心脏抽出约0.5 ml血浆并注入含3%枸橼酸钠的离心管中，3500 r/min离心5 min，收集上清并按照试剂盒说明书测定乳酸(LD)含量和乳酸脱氢酶(LDH)活力。

2结果

2.1化合物结构表征

2.1.1化合物1：白色粉末1.62 g，产率90%。ESI-MS(m/z)：181[M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz) δ：13.16(s，1 H)，9.89(s，1 H)，7.88(t，2 H)，7.15(t，2 H)，4.9(s，2 H)。13C-NMR(DMSO-d6，100 MHz)δ：190.6，169.7，162.7，131.8，131.6，130.0，115.0，64.6。

2.1.2化合物2：白色粉末1.00 g，产率72%。ESI-MS(m/z)：280 [M+H]+。1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ：9.92(s，1 H)，7.89(d，J=8.4 Hz，2 H)，7.07(d，J=8.4 Hz，2 H)，6.92(s，1 H)，4.58(s，2 H)，3.68(s，3 H)，3.40~3.45(m，2 H)，2.40 (t，2 H)，1.88~1.95(m，2 H)。13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ：190.35，173.66，167.2，161.7，132.1，130.9，114.9，67.1，51.9，38.6，31.3，24.30。

2.1.3化合物3：蓝色油状物1.11 g，产率55%。ESI-MS(m/z)：407 [M+H]+。IR(KBr)：3365，2992，1735，1670，1604，1536，1360，1299，1258，1188，1046，836 cm-1。EPR(CH3OH)：五重峰，g=2.0068，|aN|=7.74 G。Anal. Calcd for C20H28N3O6：C 59.10，H 6.94，N 10.34； Found：C 58.88，H 7.23，N 10.72。

2.2常压密闭缺氧实验3组在常压密闭缺氧实验下存活时间分别为：缺氧模型组(33.43±3.12)min、乙酰唑胺组(38.12±2.17)min、化合物3组(44.34±4.25)min。与缺氧模型组比较，乙酰唑胺组和化合物3组存活时间均明显延长，差异有统计学意义(P<0.01)，化合物3组与乙酰唑胺组比较存活时间延长(P<0.01)。

与正常对照组比较，缺氧模型组中LD含量显著升高(P<0.01)，LDH活性显著降低(P<0.01)；与缺氧模型组比较，化合物3组小鼠血浆中LD含量无显著性差异，但是LD累积速率明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，同时，LDH活性显著升高，并接近正常小鼠。见表1。

表1　4组小鼠血浆中LD含量、LD累计速率和LDH活性的比较±s)

3讨论

3.1分子设计课题组前期研究发现，NN作为一种新型自由基清除剂，能够明显延长常压密闭缺氧小鼠的存活时间，降低高原缺氧小鼠心脑组织中自由基水平，提高抗氧化酶的活力，具有明显的保护作用[11]。缺氧条件下，脑组织中神经递质代谢会出现紊乱，导致兴奋性氨基酸过量释放，从而对神经细胞产生毒性作用。GABA是中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，可通过突触后膜超极化减少离子内流，降低细胞代谢及氧消耗量，使突触后神经元处于保护性抑制状态，从而对缺氧导致的神经损伤具有明显的保护作用[12]。通过将两种作用机制不同分子结合，从而得到一种双靶标化合物，能够提高生物活性，减少用量，降低毒副作用。基于以上考虑，本文将GABA分子引入到氮氧自由基结构中，以期得到抗缺氧活性更加优异的化合物。

3.2合成方法以醛和2,3-二甲基-2,3-二羟氨基丁烷为原料，通过缩合和氧化反应是获得咪唑啉类NN的唯一方法，其中氧化过程是该方法的关键步骤。最初使用二氧化铅为氧化剂，反应为非均相体系中，同时体系呈黑色，难以监测反应进程，造成氧化剂用量大、反应时间较长、产率较低，经过改进后，使用易溶于水的高碘酸钠为氧化剂，缩短了反应时间，提高了产率。在氧化反应过程中，过氧化是最主要的副反应，通过对反应条件的摸索，利用缩合产物难溶于有机溶剂而NN易溶于CH2Cl2的性质，使用二氯甲烷和水的混合溶剂，将生成自由基产物及时萃取到CH2Cl2中，减少与高碘酸钠的接触，同时采取降低反应温度，严格控制氧化剂的用量和反应时间等措施，最大限度的减少过氧化产物的生成，以较高的产率得到了目标化合物3。

3.3结构表征在化合物1的1H-NMR谱和13C-NMR中，δ:13.16和190.6分别为羧基中氢和羰基碳的质子信号，同时δ:4.9出现亚甲基质子信号，表明分子结构包含了-CH2COOH结构。质谱检测分子量与目标化合物一致。

化合物2的1H-NMR谱中，δ:6.92为仲胺基质子信号，-OMe 在δ:3.68处为一个尖锐的单峰，同时羧基中氢质子信号消失，从13C-NMR中可以看出，δ:190.35和173.66分别为酰胺和酯基中羰基碳质子信号，同时结构中增加了三个亚甲基和一个甲氧基质子信号，表明4-氨基丁酸甲酯已经成功引入化合物1中。

由于NN在核磁中无信号，因此无法通过NMR对其结构进行表征，在化合物3的红外谱图中，酰胺键中N-H的伸缩振动出现在3365 cm-1，1650和1735 cm-1的分别为酰胺和酯基中羰基的特征吸收峰，1360 cm-1出现典型N-O键吸收峰；1208和1604 cm-1出现C-N和C=N键特征吸收峰，836 cm-1为苯环1,4-取代特征峰；电子顺磁共振(electron paramagnetic resonance， EPR)是观察和检测自由基等顺磁性物质的一种最直接、最有效的方法，是检测和识别自由基不可缺少的工具[13]。以无水甲醇为溶剂，化合物3的EPR谱呈现对称的五重峰，各峰强度比为1∶2∶3∶2∶1，表明分子存在单电子自由基结构，见图3。化合物3的质谱和元素分析结果与其分子量和分子式一致。

3.4抗缺氧活性研究常压密闭缺氧为非特异性缺氧[14]，最终会造成小鼠窒息死亡，存活时间的长短可以反映药物的抗缺氧作用。通过该模型对所合成的目标化合物3进行活性评价，结果表明：与缺氧模型组相比，化合物3能延长常压密闭小鼠的存活时间，且活性优于乙酰唑胺组。

图3　化合物3的电子顺磁共振谱

LD是糖酵解的代谢产物，其含量的变化可以反映机体损伤的程度[15]。结果显示：缺氧模型组较正常对照组LD含量显著升高，虽然化合物3组LD含量较缺氧组无显著变化，但是其LD累积速率明显降低，表明化合物3虽然不能避免缺氧小鼠出现酸中毒，但是可以延缓其出现的时间。LDH是一种糖酵解酶，存在于机体所有组织细胞的胞质内，能够催化丙酮酸和乳酸相互转变，其水平变化可以反映对机体乳酸代谢的情况[16]。缺氧导致LDH活力显著下降，化合物3能够维持缺氧小鼠中LDH活力，缓解缺氧导致的乳酸蓄积。

综上所述，本文将NN与GABA通过酰胺键相连，合成了一种新型偶联物，采取的合成路线短、方法简单，条件温和，产物结构经IR、EPR、EI-MS和元素分析与目标化合物一致，并通过常压密闭缺氧实验对其活性进行评价，结果表明化合物3具有明显的抗缺氧作用。

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(收稿时间：2015-09-22修回时间：2015-10-25)

缺氧与抗氧化研究专题

·论著·

A Study on Design, Synthesis and Anti-hypoxia Activity of Nitronyl Nitroxide-γ-aminobutyric Acid Conjugate

JING Lin-lin, MA Hui-ping, FAN Peng-cheng, HE Lei, JIA Zheng-ping (Key Laboratory of Prevention and Cure for the Plateau Environmental Damage of PLA, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command, lanzhou 730050, China)

[Abstract]ObjectiveTo design the synthesis of a nitronyl nitroxide-γ-aminobutyric acid conjugate and to investigate its anti-hypoxia activity. MethodsA nitronyl nitroxide-γ-aminobutyric acid conjugate (compound 3) was achieved via etherification, amidation, condensation and oxidizing reaction using 4-hydroxybenzaldehyde, ethyl bromoacetate， methyl 4-aminobutyrate hydrochloride and 2, 3-dimethyl-2, 3-dihydroxylamino butane as starting materials. The anti-hypoxic activities of the compound were evaluated using the normobaric hypoxia experiment of mice. ResultsCompared with those in the hypoxia model group, Acetazolamide and compound 3 groups had significantly prolonged survival time in the three groups under normobaric hypoxia experiment, and the differences were statistically significant (P<0.01). The survival time of mice in compound 3 group was significantly longer than that in Acetazolamide group (P<0.01). Compared with those in the normal control group, the lactic acid (LD) content was significantly increased, while the l-lactate dehydrogenase (LDH) activity was significantly decreased in compound 3 group (P<0.01). Compared with those in the hypoxia model group, the LD content had no significant changes, but the LD accumulation rate was significantly decreased in compound 3 group (P<0.01). ConclusionThe synthetic route of the nitronyl nitroxide-γ-aminobutyric acid conjugate is rational and simple with high yield, and it exhibits excellent anti-hypoxic activity.

[Key words]Nitronyl nitroxide; γ-aminobutyric acid; Design and synthesis; Anti-hypoxia activity

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.12.001

[文献标志码][中国图书资料分类号]R34A

[文章编号]2095-140X(2015)12-0001-04

[通讯作者]贾正平，E-mail：1026573411@qq.com

[基金项目][作者单位]730050 兰州，兰州军区兰州总医院药剂科全军高原损伤防治重点实验室