红曲霉液体发酵合成 γ－氨基丁酸的研究

史红征 吴彦彦 史晓静 钟凯 魏旭颖 朱会霞

γ-氨基丁酸是一种天然的、食品级的、对人体具有多种功效的非蛋白质氨基酸，由谷氨酸经谷氨酸脱羧酶催化脱羧而来。2009年，原卫生部允许γ-氨基丁酸在食品生产加工中适量添加使用。食品工业中生产γ-氨基丁酸常用微生物发酵法，红曲霉是其中最常用的微生物。本文通过研究发酵对红曲霉γ-氨基丁酸生物合成的影响，为红曲霉高产γ-氨基丁酸培养条件的优化提供依据。

一、菌种

红曲霉菌种保存于衡水学院发酵工程实验室。

二、实验与方法

1.红曲霉的液体培養。将斜面红曲霉菌株接种至液体豆芽汁培养基中，在30℃条件下培养5d，将菌丝球再次转接液体培养基后分成2组，一组在摇床上经30℃、150r/min震荡培养;另一组经30℃静置培养，每日观察。

2.γ-氨基丁酸的含量测定。按照刘梦云等《GABA产生菌的筛选以及检测方法的比较研究》，测定γ-氨基丁酸的含量。

3.培养基的优化。前期实验所用的是豆芽汁、葡萄糖和酵母膏的液体培养基，从成本考虑改为豆粕粉、大米粉和酵母膏的液体培养基，做正交试验确定培养基。

4.分析优化后的培养基的最佳转速。优化的培养基中因为加入了豆粕粉和大米粉而变得粘稠，将优化培养基接种红曲霉菌种，然后分别在90r/min、120r/min、              150r/min、180r/min、210r/min的转速下，在摇床上经30℃培养。观察培养基的变化，并测定γ-氨基丁酸的含量以确定最佳转速。

三、结果与分析

1.红曲霉静置培养和摇床培养液体培养状态的差异。（1）静置培养的红曲霉液体培养物因为没有摇床的震荡分散作用，形成的菌丝粘连为片状且为白色。随着培养时间的增加，红曲霉菌丝逐渐增多且成团，菌丝团中间的颜色也变为红色，边缘的菌丝仍为白色，培养液的颜色变化不明显。（2）在摇床中培养的液体培养物由于震荡、分散和回旋的作用，发酵液中供氧充足有利于菌丝的扩增，形成了大量的菌丝球。随着培养时间的增加，菌丝球渐渐变大，其颜色由白色变为红色;培养液的颜色渐渐加深，最后变为紫红色，其主要是由红曲色素的积累增加所导致。

2.红曲霉液体培养菌丝观察。（1）观察不同培养时间下摇床菌丝的形态，初期菌丝有横膈、无色透亮;中期菌丝开始出现无规则的分支，菌丝之间网状联合、分布密集;培养后期菌丝体开始形成孢子并不断生长，并有部分孢子萌发。（2）静置状态下培养的红曲霉菌丝分支较少，且菌丝分布稀疏、密度较小，更易观察。通常在梗顶端生出倒梨形或球形的分生孢子。

3.γ-氨基丁酸含量的测定。（1）随着红曲霉培养时间的增加，摇床培养液和静置培养液中的γ-氨基丁酸生成量均逐渐增多，在培养至第5天时均达到最大值（摇床培养液和静置培养液中分别是113.9mg/L和93.5mg/L），并且摇床培养液中的γ-氨基酸含量高于静置培养液。在此基础上继续培养，摇床培养液和静置培养液中的γ-氨基丁酸含量反而下降。（2）每天将红曲霉摇床培养基和静置培养基过滤后获得菌丝，测定菌丝中的γ-氨基丁酸含量，其也随培养天数的增长而增加。但菌丝中γ-氨基丁酸含量达到最大值的时间与培养液有差异，在第6天时γ-氨基丁酸达到最大值（摇床培养菌丝和静置培养菌丝中分别是101.3mg/L和94.6mg/L）。

摇床培养液和菌丝中的γ-氨基丁酸含量均分别高于静置培养液和菌丝中的含量，原因在于红曲霉是极好氧微生物，摇床培养比静置培养能提供更多氧，有利于基质转化为γ-氨基丁酸。因此，红曲霉合成γ-氨基丁酸的最佳方式是摇床培养，在此条件下最佳发酵天数是5d。综上可知，摇床培养液中的γ-氨基丁酸含量高于摇床菌丝。摇床培养液中的γ-氨基丁酸含量高，并且能快速地应用工业方法提取，而从菌丝中提取γ-氨基丁酸的工艺复杂、消耗较大，在工业生产中并不实用。

4.优化液体培养基。对R值（表1）进行分析发现，豆粕粉的影响最大，大米粉的影响较小，而酵母膏对γ-氨基丁酸的产量基本没有影响。分析K值，确定三种原料的最佳比例是A2B2C1，即每1L培养基中加入豆粕粉20g、大米粉40g、酵母膏5g。然而，A2B2C1组合并未在正交实验中出现，因此需进行验证实验。验证实验证实，A2B2C1组合的γ-氨基丁酸含量为240.31mg/L，高于正交实验中最高量233.41mg/L，说明正交实验得到的最优组合的确为γ-氨基丁酸含量最高的培养基配比。

5.摇床转速对红曲霉合成γ-氨基丁酸的影响。90r/min培养物中基本没有泡沫，γ-氨基丁酸含量为182.7mg/L;120r/min和150r/min培养物中的泡沫很少，γ-氨基丁酸含量分别为216.3mg/L和260.1mg/L;180r/min培养物中，γ-氨基丁酸含量为为268.7mg/L，但产生的泡沫很多，有染菌的危险，而且γ-氨基丁酸产量与150r/min产量相差不多;210r/min培养物中的γ-氨基丁酸含量为223.6mg/L，但产生太多的泡沫，损失较大。因此，150r/min进行摇床培养是生产γ-氨基丁酸的最佳转速条件。

四、结论

本文分析了培养条件、培养基组成、摇床转速等因素对红曲霉中γ-氨基丁酸合成的影响，实验结果将为红曲霉合成γ-氨基丁酸的进一步研究提供理论依据。

基金项目：国家级大学生创新创业训练计划项目，项目编号：202010101008。

作者简介：史红征（2000-），女，河北保定人，在读本科，研究方向为食品质量与安全。

*通信作者：朱会霞（1977-），女，河北景县人，教授，博士研究生，研究方向为发酵工程、中药发酵。