制备色谱及其在药物研究中的应用

贾　丹,陈啸飞，丁　璇，朱臻宇,柴逸峰,张　川

[1.第二军医大学药学院药物分析学教研室，上海市药物(中药)代谢产物研究重点实验室，上海 200433；2.第二军医大学药学院中药鉴定学教研室，上海 200433；3.第二军医大学药学院，上海 200433；4.第二军医大学药学院分析测试中心，上海 200433]



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制备色谱及其在药物研究中的应用

贾丹1,2,陈啸飞3，丁璇1，朱臻宇4,柴逸峰3,张川2*

[1.第二军医大学药学院药物分析学教研室，上海市药物(中药)代谢产物研究重点实验室，上海 200433；2.第二军医大学药学院中药鉴定学教研室，上海 200433；3.第二军医大学药学院，上海 200433；4.第二军医大学药学院分析测试中心，上海 200433]

[摘要]制备色谱作为天然产物分离纯化的有效手段，具有操作简便、产品纯度高、分离速度快等优点。本文综述了近年来液相制备色谱(高效液相制备色谱、高速逆流色谱、模拟移动床色谱、超临界流体色谱)和气相制备色谱的最新研究进展，以及不同制备色谱在药物研究中的应用现状和前景。

[关键词]制备色谱；应用模式；药物研究；综述

[Pharm Care Res，2015，15(3): 161-165]

从20世纪初发展至今，色谱技术已由分析规模发展到制备和生产规模，在药物研究尤其是活性成分的分离纯化中发挥着越来越重要的作用。制备色谱并非分析色谱的简单放大：分析型色谱是通过对目标产物进行定性或定量分析，获取反映样品组成的信息，无需收集特定组分；制备型色谱则是按一定纯度要求，分离、富集或纯化一定量的目标产物进行后续研究，需考虑目标产物的产率、纯度等[1]。本文简要介绍了制备色谱的类型、应用模式，并对其在药物研究中的应用进行综述。

1制备色谱的类型

1.1高效液相制备色谱液相制备色谱根据分离过程中的压力分为低压制备色谱(<0.5 MPa)、中压制备色谱(0.5～2 MPa)和高压制备色谱(>2 MPa)，其中高压制备色谱又称高效液相制备色谱(preparative high performance liquid chromatography, Pre-HPLC)，是利用更细粒径的填料、高流速进行分离。根据分离样品的负载量分为研究开发型和工业生产型。根据分离原理分为正相、反相、体积排阻及离子交换四种模式。

Pre-HPLC体系由控制系统、高压输液泵、自动进样器、制备型色谱柱、检测器及成分收集器等组成，其中制备色谱柱是核心，色谱填料的填装方式是影响柱效的关键因素。Forssén等[2]研究了色谱柱(柱径、柱长及柱型)、填料(种类、尺寸及装填方法)、流动相(组成、流速)及样品(性质、上样量)等影响液相制备色谱分离纯化效率的因素，发现短柱、高压可提高产率，而样品浓度和柱效对最大产率的影响极微。

1.2高速逆流色谱高速逆流色谱(high-speed counter-current chromatography, HSCCC)是20世纪80年代发展起来的一种液液分配色谱技术，一相为固定相，另一相为流动相，在高速旋转的分离管中，实现一种特殊的单向流体动力学平衡。物质根据在两相中分配系数不同实现分离，避免了不可逆吸附引起的样品变性、失活等，而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触，大大提高了样品回收率。Li等[3]通过考察进样量、分离时间、溶剂消耗量及产出量等参数，将逆流色谱与Pre-HPLC进行了比较，发现前者具有大进样量(尤其是溶解度低的样品)、低溶剂消耗量、高产率等优点。

HSCCC体系主要由输液泵、进样阀、螺旋管式离心分离管、检测器及馏分收集器等组成，影响其制备分离效率的因素主要有两相溶剂体系的组成、组分的分配系数、洗脱模式、流速、温度及相连检测技术等，其中选择恰当的溶剂体系是HSCCC方法建立过程中最重要和最耗时的步骤[4]。

1.3模拟移动床色谱模拟移动床(simulated moving bed,SMB)色谱是20世纪60年代研制开发的一种现代化分离技术，是最适于连续性大规模工业化生产的色谱技术之一。它将模拟移动床的设计理念融入液相制备色谱中，实现了二者的结合，既保持了液相制备色谱分离纯度高、消耗小、可变温操作的优点，又克服了其不能连续操作的缺点，具有分离效率高、固定相利用率高、自动化连续操作等优点，尤其适于两组分体系的分离。从20世纪90年代开始，出现了一些新型SMB操作方式，其中一种将化学反应和模拟移动床结合的技术——SMB色谱反应器被广泛应用[5]。SMB通过变换固定床吸附设备物料进出口的位置，以逆流连续操作的方式，产生一种类似于物料连续向上、吸附剂连续向下移动的效果。通常利用特定的装置(如旋转阀)，使四个物料口以与固定相浓度变化相同的速度上移，从而形成一个闭合的回路，实现保持进出口位置不动、固定吸附剂在吸附器中自上而下移动的效果。

1.4超临界流体色谱超临界流体色谱(supercritical fluid chromatography,SFC)是20世纪60年代发展起来的一种以超临界流体为流动相、以键合到载体上的高聚物为固定相的色谱技术，具有气体黏度低、液体溶解能力强、扩散系数大等优点，广泛用于手性化合物的分离制备。Yan等[6]将SFC与其他制备色谱(HPLC、稳态循环色谱、SMB色谱)进行了比较，发现其具有高效、高通量、低溶剂消耗量等优势。

SFC依据各组分在两相间分配系数不同实现分离。超临界CO2因低毒、溶解度及洗脱能力随压力升高而增大、可实现梯度洗脱等，成为制备型SFC中最常用的流动相[7]。对于中等极性物质的分离，多数情况需添加少量的改性剂(甲醇、异丙醇等)，以增强流动相的洗脱能力，提高选择性和分离效率。制备型SFC体系主要由高压流动相输送系统、色谱分离系统、检测系统及样品收集系统组成。

1.5气相制备色谱气相制备色谱(preparative gas chromatography,pGC)是对上述制备色谱技术的一个补充，尤其适用于萜烯类及其他挥发性物质的制备分离。根据固定相的状态，分为气-固色谱法和气-液色谱法，分别依据物质在两相间的吸附系数和分配系数不同实现分离。pGC体系主要由载气系统、进样系统、色谱柱、分流装置、检测器及样品收集系统组成，为获得高纯度的目标产物，在样品收集系统中运用了可控阀门、阀切换等技术。Zuo等[8]对pGC的进样装置、色谱柱、分流系统、检测器等进行了较为全面的介绍。

与其他制备色谱相比，pGC的应用还受到一定限制，除了受样品性质的约束，另外还有：(1)大体积气相制备色谱柱需要的载气量多且不可回收利用；(2)样品进入色谱柱前必须被充分雾化；(3)从色谱柱流出的目标成分浓度低，很难实现高效率收集；(4)很难像液相制备色谱那样，实现工业规模的自动化生产。

2制备色谱的应用模式

为满足生物技术、医药化工等行业快速发展的需求，制备色谱的应用模式不只局限于单一技术的一维模式，还出现了几种制备色谱技术的二维或多维联用及不同技术间的融合模式。

2.1制备色谱的二维及多维模式二维或多维制备色谱通常是将分离机制不同的两种或多种色谱系统结合起来，实现不同色谱技术间的补充。样品经过第一维系统被浓缩、富集之后，进一步被切换至第二维甚至三维系统，然后经检测器被分离收集。二维或多维系统通过不同的分离机制，使得样品中的各成分依据不同的特性分离开来。在一维体系中不能完全分开的组分，在二维、三维甚至多维体系中可得到更好的分离。与单一的一维体系相比较，二维及多维体系具有分离能力强、分离效率高、产量高等优势。随着色谱技术的发展，二维及多维制备色谱由离线发展到在线方式，使得一维中的洗脱物部分或全部在线、直接进入后续系统中进行制备分离。二维制备色谱系统的应用实例见表1。

三维或多维系统多由pGC组成，Sciarrone等[13]利用三维pGC及核磁共振/红外/质谱，从黄皮中快速收集了一种新物质，制备量达毫克级，鉴定为(2E，6E)-2-甲基-6-(4-甲基环-3-亚丙烯基)庚-2-烯醛。另外，其课题组通过正相液相色谱及GC建立了一个四维系统[14]，从香根草精油中分离出两种含量极低的组分，纯度高达90%，弥补了液相制备色谱分离能力弱,及pGC载样量低的缺点。

表1　二维制备色谱系统的应用

2.2不同制备色谱技术的融合模式目前应用较多的是超临界流体及SMB色谱与其他色谱技术的融合。Denet等[15]对超临界模拟移动床色谱分离技术进行了研究；Gomes等[16]利用气相模拟移动床色谱分离了丙烷、丙烯混合物，纯度和回收率分别高达99.5%和99.0%；Cristancho等[17]采用超临界流体-模拟移动床色谱分离了亚油酸乙酯和油酸乙酯；Cao等[18]通过超临界流体-HSCCC实现了葡萄籽油及葡萄籽脱脂油的生产。

3制备色谱在药物研究中的应用

3.1在中药及天然产物研究中的应用天然产物是活性药物成分的重要来源，从中寻找先导化合物并进行结构修饰是新药研发的热点。中药是我国传统的宝贵资源，其种类繁多、成分复杂、性质各异，如何将有效成分分离纯化后进行药理药效研究是中药现代化的关键问题之一。制备色谱技术作为天然产物分离纯化的有效手段，快速简便、产品纯度高。

Liu等[19]采用离子液体为HSCCC的改性剂，从木蝴蝶中分离制备出黄芩素-7-O-二葡萄糖苷和黄芩素-7-O-葡萄糖苷，产率和纯度分别为30.3%、50.4%和98.7%、99.1%。许青青等[20]采用SMB色谱分离纯化了药物中间体链甾醇，产率和纯度分别高达93.8%、98.9%。Wang等[21]利用中压液相色谱、HSCCC及Pre-HPLC从榕树叶中分离纯化出四种黄酮C-糖苷，纯度均>92%。另外，某些制备色谱因达到一定的产率和纯度要求，已用于对照品的制备。廖茂梁等[22]利用中低压制备色谱建立了从枳实中分离制备柚皮苷和新橙皮苷对照品的方法，质量分数分别高达98.76%和99.50%。李小艳等[23]通过中低压正相色谱及高压反相色谱建立了从泽泻中快速高效制备23-乙酰泽泻醇B对照品的方法，每次可从2 g泽泻乙酸乙酯粗提物中分离出40.2 mg 23-乙酰泽泻醇B。

3.2在手性药物研究中的应用手性药物广泛存在于天然和半合成药物中，在全合成药物中占到了40%。维持生命活动的生物大分子(如蛋白质、核酸等)也几乎全是手性的，二者之间通过严格手性匹配与分子识别产生相互作用。手性药物对映体的药理活性、代谢过程及毒性存在显著差异，往往两种异构体中仅有一种是有效的，另一种无效甚至有害。因此，如何将两种对映体快速高效地分离开来是手性药物研究中的关键问题之一。SFC、SMB色谱等制备色谱技术在对映体的分离纯化中具有独特的优势，且后者已被国际上公认为拆分手性药物的最有效手段。Li等[24]通过HSCCC从红花中分离纯化了4种香豆精胺类似物顺反异构体，纯度均>95%。孙玉高等[25]利用平衡扩散模型对酮洛芬对映体在4区SMB上的拆分进行模拟研究，对其试生产具有一定的指导意义。Zuo等[26]通过pGC从石菖蒲中分离了顺反细辛脑。

3.3在药物代谢产物研究中的应用药物代谢是影响其发挥药效及产生毒性的过程，获得药物代谢方式、途径等信息，有助于药物的研究和临床合理用药。FDA明确要求，新药上市时不仅要明确其体内代谢动力学特征，还需明确它们的代谢产物。当样品浓度较高或检测方法具有足够的灵敏度时，样品经常规前处理后即可直接测定；但当药物浓度较低或分析方法的特异性或灵敏度较差时，样品需进行分离、纯化或浓集后测定。因此，代谢产物的分离纯化是药物研究中的关键问题之一，高通量药物的吸收、分布、代谢及排泄性质筛选需要匹配高效、高灵敏度及低耗费的分离纯化技术。制备色谱的快速高效性是其他分离技术无法比拟的，在药物代谢产物的研究中具有一定的应用前景。

Hsieh等[27]通过SFC及大气压化学离子质谱进行了氯氮平等药物的体外代谢稳定性实验，准确度高、精密度好、快速高效。Dear等[28]通过Pre-HPLC及超低温核磁共振光谱建立了人血浆中药物代谢物的检测方法，实现了对一种浓度低至10 ng/ml的新代谢物的定性定量分析。

3.4在靶标蛋白质等研究中的应用制备色谱技术还用于药物靶标蛋白质、酶等生物活性大分子的研究。Sun等[29]介绍了制备色谱技术在蛋白质分离纯化中的应用，Mangas等[30]通过Pre-HPLC分离纯化了大脑中有机磷化合物的靶标胆碱酯酶。

4结语

经典柱层析色谱法虽可用于大量样品的处理，但效率低、费时且消耗溶剂量大；制备薄层层析法简便，但处理样品量有一定局限。而制备色谱技术因柱效高、分离速度快等特点，不论在基础研究中的富集性分离，还是在工业上规模化生产中，都是分离纯化天然产物及化学合成产物的有效技术手段，在医药、食品、精细化工等行业具有广阔的发展和应用前景。同时也应该认识到，不同的制备色谱技术具有不同的优缺点，使用时需根据目标组分的性质和特点进行选择。二维或多维制备色谱技术联用及不同技术间的融合模式，既在一定程度上结合了不同技术的优点又弥补各自的不足，是一种很好的选择。

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[修回日期]2015-05-18

[本文编辑]阳凌燕

Preparative chromatography and its applications in drug research

JIA Dan1,2,CHEN XiaoFei3,DING Xuan1,ZHU ZhenYu4,CHAI YiFeng3,ZHANG Chuan2*

[1.Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Second Military Medical University，Shanghai Key Laboratory for Pharmaceutical(Chinese Materia Medica) Metabolites Research,Shanghai 200433,China;2.Department of Authentication of Chinese Medicine,School of Pharmacy,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China;3.School of Pharmacy,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China;4.Pharmaceutical Analysis Center,School of Pharmacy,Second Military Medical University, Shanghai 200433,China]

[ABSTRACT]As an effective technology, preparative chromatography has shown greater convenience, higher purity and speed in separation and purification of active ingredients from natural products. This article briefly described the most recently research progress in preparative liquid chromatography (including preparative high performance liquid chromatography, high-speed counter-current chromatography, simulated moving bed chromatography and supercritical fluid chromatography) and preparative gas chromatography, the proposed progresses and encouraging prospects in drug research were also reviewed.

[KEY WORDS]preparative chromatography;application mode;drug research；review

[收稿日期]2014-11-25

DOI：10.5428/pcar20150301

[中图分类号]R917

[文献标志码]A

[文章编号]1671-2838(2015)03-0161-05

作者简介贾丹(女),硕士生.E-mail:jiadanjiayou91@sina.com*通信作者(Corresponding author)：张川,E-mail:zhangchuan@smmu.edu.cn