mTOR信号通路在生精细胞发育中的作用

夏 静 牛长敏 马海涛 申雪沂 王建军 综述 郑 英 审校

扬州大学医学院 组织学与胚胎学教研室（江苏扬州 225001）

mTOR信号通路在生精细胞发育中的作用

夏 静 牛长敏 马海涛 申雪沂 王建军 综述 郑 英 审校

扬州大学医学院 组织学与胚胎学教研室（江苏扬州 225001）

精子发生是指精原细胞经过一系列分裂分化演变为精子的过程,包括精原干细胞的增殖及其子细胞分化、精母细胞的减数分裂和精子形成三个阶段。许多研究表明mTOR信号通路参与精子发生的各个阶段。本文主要就mTOR信号通路在生精细胞发育的不同阶段中的作用做一综述。

一、mTOR信号通路

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）广泛存在于各种生物细胞中，是细胞生长的中心调控因子[1]。它存在两个功能不同的复合物，mTORC1和mTORC2。其中mTORC1起主要作用，mTORC1包含mTOR、调节蛋白Raptor和其他结合蛋白，是抑制剂雷帕霉素的主要作用靶点，主要参与调节细胞生长、增殖和蛋白质合成。mTOR主要受磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT/PKB）信号通路的调节。mTOR通过对其下游翻译相关蛋白：核糖体40s小亚基S6蛋白激酶（70-ku ribosomal protein S6 kinase，p70S6K）、真核细胞翻译启动因子4E结合蛋白1（eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein，4E-BP1）、真核细胞翻译启动因子4B（eukaryotic translation initiation factor 4B，eIF-4B）以及核糖体蛋白S6（ribosomal protein S6，rPS6）的磷酸化而发挥调控作用。其中4E-BP1是翻译的负调控子，它与基因mRNA 5’端帽状结合蛋白eIF-4E结合并抑制其活性，阻止翻译起始。当上游某一信号刺激后，使mTOR磷酸化，磷酸化的mTOR使4E-BP1失活，导致4E-BP1与eIF-4E解离，游离的eIF-4E与eIF-4G、eIF-4B、eIF-4A结合形成eIF-4F起始复合物，结合到mRNA 5’末端的帽结构上，促进翻译起始[2]。因此，mTOR活化的目的是使翻译起始复合物形成，从而调控依赖性靶向mRNA的翻译。

二、mTOR信号通路与精原细胞发育

精子发生始于SSCs，SSCs一部分自我更新（维持干细胞池），另一部分则分裂分化为Aal型精原细胞，Aal型精原细胞再分化为A1-A4、In及B型精原细胞。B型精原细胞演变成初级精母细胞，而mTOR可以通过多种信号通路来调控其增殖分化中相关基因的表达。

（一）mTOR在精原干细胞增殖中的作用

精原干细胞来源于原始生殖细胞，其依赖受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase, c-Kit）与干细胞因子（stem cell factor, SCF）相互作用而迁移至未分化性腺，启动其增殖分化。研究发现雄鼠突变体由于SCF/c-kit不能激活PI3K通路而导致精子发生缺陷，表现出精原干细胞增殖能力减弱及细胞异常凋亡[3]。Feng等证实了SCF/c-KIT通过PI3K/AKT/mTOR信号的活化使细胞周期蛋白D3表达上调，促进G1 期到S 期，从而加速细胞周期[4]。而这条通路对G1期的细胞周期调节蛋白D1、CDK4、CDC25A 的合成均有抑制作用[4]。Busada等发现RA可通过PI3K/AKT/m TOR信号通路诱导精原细胞内c-Kit蛋白的合成[5]。推测：在精子发生中，PI3K/AKT/m TOR信号通路可能与c-kit存在反馈调节。mTOR通过磷酸化激活下游信号分子p70S6K，促进精原干细胞增殖分化中蛋白质的合成，随着年龄的增长，mTOR蛋白表达下降且其对下游靶蛋白p70S6K的磷酸化能力下降，导致精子数量减少、生精小管空泡化增多[6]。以上研究表明，c-Kit与PI3K/ AKT/mTOR信号通路对有丝分裂增殖的调控是必不可少的。Huang等发现在大鼠睾丸内，胰岛素样生长因子受体1（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF -1R）-PI3K/AKT/mTOR/缺氧诱导因子2α（hypoxia inducible factor 2α，HIF-2α）信号通路调控着精原干细胞的增殖[7]。在培养的原始生殖细胞中，干扰IGF-1R表达或用PI3K抑制剂LY294002或雷帕霉素处理，均可有效抑制IGF-1R或八聚体结合转录因子4（octamer-binding transcription factor 4, Oct-4）与HIF-2α的表达，使原始生殖细胞数量明显减少[7]。Hobbs等发现在敲除早幼粒细胞白血病锌指蛋白（promyelocytic leukemia zinc fnger, PLZF）的大鼠精原干细胞模型中，过度活化的mTORC1可抑制精原干细胞对胶质细胞源性神经营养因子（glial-derived neurotrophic factor，GDNF）的反应并导致精原干细胞池中各型精原细胞数量显著减少[8]。GDNF是精原干细胞增殖的关键因子，其调控SSCs自我更新和分化平衡[9]。另外，PLZF可通过诱导mTORC1抑制剂活化来抑制发育及DNA损伤反应调节基因1（regulated in development and DNA damageresponses 1, redd1）的表达[8]。

综上所述， PI3K/AKT/m TOR与多种信号分子共同调控精原干细胞增殖分化，使其有序正常进行。

（二）mTOR在精原细胞分化中的作用

从Aal型精原细胞依次分化形成 A1、A2、A3、A4、In、B型精原细胞，其过程即A型精原细胞分化，而mTORC1的活性对分化相关基因的翻译是必须的。

Busada等研究用雷帕霉素检测了mTORC1对小鼠精原细胞分化的影响，发现mTORC1活化对未分化精原细胞的维持是非必需的，而对精原细胞分化的启动是必不可少的[10]。众所周知，RA对精原细胞分化起着重要调控作用，其中一条通路即是RA与其受体RARA结合作用于RAREs反应元件上，再结合到PI3K的调节亚基p85或催化亚基p110β后诱导ERK（细胞外信号调节激酶）及AKT的磷酸化，而mTOR有AKT磷酸化位点（Trh2446及Ser2448），使mTOR也被磷酸化，发挥激活下游蛋白功能[11]。在成年睾丸中雷帕霉素能使Stra8的表达降低，它是RA的一个直接调控靶基因，参与精原细胞分化[12]。同样雷帕霉素也阻碍了分化相关基因Rhox13、Kit、Sohlh1、Sohlh2等mRNA的翻译[10]。Rhox13（X-linked reproductive homeobox gene 13）是一个生殖同源框基因，在分化的精原细胞内它应答RA后表达上调，它的敲除将导致第一批生精波中生殖细胞凋亡、圆形精子出现的时间延迟[13]。精子发生与卵子发生特异性螺旋绕螺因子1（spermatogenesis and oogenesis specific basic helix-loop-helix 1, Sohlh1）、Sohlh2在分化的精原细胞中表达明显增加，且Sohlh1、Sohlh2可以形成异二聚体，结合在Sohlh1基因上游的启动子序列SP1上，启动精原细胞分化，而两者均可促进Kit在精原细胞中表达[14]。出生7 d 小鼠睾丸内Sohlh1 功能缺失会导致一系列基因表达变化，如在精原细胞分裂过程中起重要作用的 LIM同源基因 Lhx8 的表达降低，同时与精原细胞分化相关的一些基因如Kit、Ngn3和Crabp1的表达也会减少；Sohlh1 功能缺失的同时，睾丸也会表达一些特有的转录因子，如 Etv5、ERM、Taf-4b 和 PLZF，这些基因对精原细胞的增殖和分化有着重要的作用[15]。以上研究说明mTORC1信号通路的活化与否可以直接或间接影响分化相关基因的表达。另有研究发现RA也可通过与支持细胞表面受体KITL结合后激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，使分化基因Kit蛋白表达[5]。

综上所述，精原细胞通过PI3K/AKT/mTORC1信号通路应答视黄酸进行分化时，是以转录活性形式及增加激酶信号双重应答的。

三、 mTOR对减数分裂细胞及其子细胞的作用

SSC经过有丝分裂后分化为初级精母细胞，随后进入减数分裂形成圆形精子细胞。研究发现：与圆形精子细胞相比，精母细胞表现出更高水平的蛋白合成，这是通过rPS6的磷酸化翻译水平的增加来实现的，rPS6也是mTOR下游分子，翻译的标记物；磷酸化的rPS6在圆形精子细胞中是显著降低的[16]，说明精母细胞及圆形精子细胞中翻译的比例与rPS6磷酸化水平都是不同的。然而，在精子发生的后期rPS6磷酸化水平升高，与实验中检测出低蛋白合成率和mTOR表达水平显著下降的结果不一致，这可能是由于p90RSK对rPS6磷酸化的调控所致[17]。p70S6K是mTOR下游的靶蛋白，它通过磷酸化核糖体S6蛋白质调节具有5’TOP的mRNAs,继而调节数百种生物因子的转录。有研究发现在敲除p70S6K基因的果蝇细胞中，细胞周期延长到正常的二倍，这说明p70S6K在细胞周期进程中也有它的生理作用[18]。而在初级精母细胞中p70S6K有明显表达，但胞核的着色明显深于胞浆，而在精子中则无此趋势[16]。精子形成以后精核高度浓缩，其转录与合成代谢水平低，精子合成p70S6K的可能性不大，这说明在生精过程中，p70S6K可能从胞核转移到胞浆。而在晚期精子变形阶段， rpS6磷酸化可能与mTOR的表达是解偶联的。这也与此期EIF4F复合物装配活性降低是一致的，这种复合物的形成通常是翻译调控中受限的一步[19]。与粗线期精母细胞相比，EIF4G 在精子细胞中明显上调，使得EIF4E与更多的 EIF4G 相互作用，从而抑制翻译。以EIF4G 结合到5’帽端相互作用的（7-methyl-GTP）EIF4E 与它在细胞内水平的比例来检测EIF4F装配的有效性，发现精母细胞表现出更高的装配有效性[19]。因为EIF4F装配主要受mTOR活性的影响，且依赖于EIF4G 和EIF4EBP1对EIF4E的竞争，而mTOR（及其靶蛋白EIF4EBP1）的表达从精原细胞到长形精子是稳定下降[20]。研究发现雷帕霉素处理后，将抑制精母细胞中mTOR及p70S6K的活性，但不抑制磷酸化的4EBP1的活性[21]。这篇研究也发现，雷帕霉素会导致几个精母细胞特异性miRNAs的表达发生改变，如：miR-15b, miR-18a, miR-34c,miR-425, miR-449a及miR-296-5p，尤其是使miR-15b, miR-18a, miR-425, miR-449a的表达水平显著下调，而miR-375及 miR-34c 表达上调[20]。这些miRNA对其靶基因起着转录后的调控作用，如miR-15b的靶基因Akt3，是PI3K信号通路中的关键分子，它的改变将使这条通路调控异常。由此说明，在正常生理状态下，mTOR也是受相关miRNA的调控，从而影响减数分裂中相关基因的表达。有关这方面的认识还需要进一步探索。另外有研究发现，用雷帕霉素处理抑制mTOR信号后，将会使细线前期精母细胞中的p-p70S6K、p-4EBP1、PCNA、Stra8的表达显著下降，从而影响减数分裂[22]；同时，也发现mTOR、p-mTOR及p70S6K在生精小管不同阶段的表达是不同的，在生精小管第Ⅶ-Ⅷ阶段的细线前期精母细胞中，mTOR及p-mTOR显著表达，p70S6K、p-p70S6K在细线期精母细胞中表达，而p-p70S6K在圆形精子细胞及管周肌样细胞中也表达。以上研究表明，mTOR及其下游信号分子参与调控精母细胞减数分裂的过程。

Boyer等发现条件性敲除支持细胞内mTOR基因后，随着精子发生的进程，成年小鼠睾丸表现出生精上皮的解体、支持细胞极性改变、生殖细胞凋亡增加、未成熟生殖细胞脱落、附睾内精子数量减少及畸形精子数量增加，从而造成不育[23]。组织学分析及阶段特异性标记蛋白表达的定量分析发现，粗线期精母细胞及精子特异性丢失，而mTOR通过调节支持细胞内紧密连接蛋白α1的分布来影响粗线期精母细胞的进程[23]。

总之，mTOR信号通路的活性及与之相关的miRNA或相关基因的表达对减数分裂细胞及其子细胞的正常发育是必须的。

结语与展望

关于mTOR作为一种对细胞增殖分化关键因子，在精子发生的各个阶段发挥着重要作用。其抑制剂雷帕霉素作为治疗器官移植后的排斥反应在临床上使用，关于其长期使用后影响男性生殖健康的原因和机制目前虽然有所认识，已有的结论与机制还不能完全诠释它们在精子发生中的作用。因此，深入探究精子发生与mTOR信号通路之间的调控机制，将为男性生育能力的调控及生殖方面疾病的诊断和治疗提供新的思路。

致谢：本文受国家自然科学基金（31371174）；扬州市社会发展科技攻关计划（2012127）基金项目资助

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白; 生精细胞;信号通路; 精子发生

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（2016-07-04收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.10.017

R 321.1