气相色谱法测定吐鲁番无核白葡萄树伤流液组成多糖的单糖

·中药及天然药物·

气相色谱法测定吐鲁番无核白葡萄树伤流液组成多糖的单糖

艾尔肯·依不拉音1，布热米古丽·买买提2，米尔扎提·麦麦提3

(1.新疆医科大学药学院，乌鲁木齐830011；2.新疆喀什地区人民医院药剂科，喀什844000； 3.新疆医科大学公共卫生学院，乌鲁木齐830011)

摘要：目的对吐鲁番葡萄树伤流液多糖进行分离纯化，并分析其单糖组成。方法采用醇沉法提取多糖，Sevage法脱蛋白，经DEAE-52纤维素柱及Sephadex G-150凝胶柱分离纯化，采用气相色谱分析单糖组成。结果用体积分数80%乙醇沉淀、Sevage法除蛋白，得葡萄树伤流液粗多糖，粗多糖经过DEAE-52纤维素柱分离得到8个多糖组分,编号分别为：组分-1，组分-2，组分-3，组分-4，组分-5，组分-6，组分-7，组分-8。其中4个多糖组分经过Sephadex G-150纯化后，通过GC分析组分-1和组分2含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖；组分-3含有鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖；组分-5含有鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。结论该方法可较好地分离纯化葡萄树伤流液多糖。采用GC分析多糖的单糖组成，研究结果适用于多糖中的单糖组成分析。

关键词：葡萄树伤流液；多糖；分离；纯化；单糖组成；气相色谱

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.03.001

中图分类号：R284

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2015)03-0221-04

Abstract:ObjectiveThe aim was to analyze the polysacchardes in Turfan grapevine bleeding sap. MethodsCrude polysaccharide was prepared by using alcohol precipitation and improved Sevage method. The obtained crude polysaccharide was purified by DEAE-52 and Sephadex G-150 column chromatography. The monosaccharide composition was analyzed by gas chromatography. Results 8 polysaccharides were obtained:components-1，components-2，components-3，components-4，components-5，components-6，components-7 and components-8； After purified， 4 polysaccharides eluting peaks were identified. From the result obtained by GC analysis，components-1 and components-2 contained rhamnose， arabinose， xylose， mannose， glucose and galactose； components-3 contained rhamnose， arabinose， glucose， mannose， and galactose； components-5 contained rhamnose， mannose， glucose and galactose.ConclusionThis method is suitable for the separation and purification of grapevine bleeding sap polysaccharide. It is applicable to analyze the monosaccharide composition of grapevine bleeding sap polysaccharides.

基金项目：国家自然科学基金项目(编号:21162030)

收稿日期：(2014-09-30)

Analysis of polysaccharides in Turfan seedless grapevine bleeding sap by GC

Arkin IBURAIM1，Buremiguli MAIMAITI2，Mizat MAIMAITI3(1.College of Pharmacy， Xinjiang Medical University， Urumqi 830011，China；2.Department of Pharmacy， Xinjiang of Kashgar People′s Hospital，Kashgar 844000， China； 3.College of Pubilic Health， Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China)

Key words: grapevine bleeding sap；polysaccharides；separation；purification；simple sugars and composition；gas chromatography

在每年的3月下旬至4月中旬，生长于新疆地区的葡萄树正处于幼叶快要发出时期，从自然或人为伤口处会流出无色透明的液体，叫作葡萄树伤流液。它是由根压引起的[1]，通常农民把它作为废料而废弃。它含有丰富的营养成分，钙、钾和谷氨酸含量较高[2]。收集葡萄树伤流液可防止自然资源的浪费，使其变废为宝。禹婷等[3]报道，以核桃、猕猴桃和葡萄为试材，分析和比较了3种果树伤流液中游离氨基酸、硝态氮和铵态氮的含量。通过进一步研究发现，葡萄树伤流液还含有一定量的多酚、氨基酸、蛋白质、矿物质[4-5]。

多糖类化合物中的活性成分不仅可作为广谱的免疫促进剂，调节机体免疫功能，还可在抗病毒、抗炎、抗溃疡、抗血栓、抗氧化、抗肿瘤、降血压、降血糖、抗辐射以及治疗艾滋病和心血管疾病等方面发挥广泛的药理作用[6-10]。多糖生物活性广、毒副作用小，是理想的免疫调节剂。近年来，随着研究技术的进步，多糖研究得到不断发展，新的多糖不断被发现，其药理作用也将被进一步深入研究[11]。到目前为止，已有300余种多糖及其活性成分从其天然产物中被分离出来，而从天然植物中提取分离的水溶性多糖最为重要[12]。有学者对新疆葡萄树伤流液总多糖含量进行分析[13]，并对喀什木纳格葡萄树伤流液多糖分解成单糖进行分析[14]，发现多糖中的单糖是控制多糖质量标准的最重要环节之一。因此，多糖中的单糖分析是一项基础研究工作。本研究对吐鲁番葡萄树伤流液中多糖进行了分离纯化，研究单糖的组成及含量测定，为开发研究葡萄树伤流液及多糖的植物资源奠定基础。

1仪器与试药

1.1仪器UV-2550紫外-可见分光光度仪(日本，岛津)；HeraeusMultifuge X3R-离心仪(美国，赛默飞世尔科技)；GC-2010Plus气相色谱仪(日本，岛津)；Mettler Toledo电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；HH-S4数据恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)。

1.2试药葡萄树伤流液：2012年3月底初采自新疆吐鲁番鄯善县，冷冻保存。样品收集方法：在葡萄树枝自然伤口或人为伤口处，靠根压溢出的葡萄树伤流液接入保鲜袋进行收集，装瓶，冷冻储存备用。蒽酮、考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白、甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)，均购于上海蓝季科技发展有限公司；D-无水葡萄糖(中国药品生物制品检定所，批号：110833-200302)；标准葡聚糖T系列，分别为T5、T10、T40、T70、T500、蓝色葡聚糖2000(均为上海谱振生物科技有限公司产品)；盐酸羟胺、三氟醋酸、无水乙醇均为国产分析纯；浓硫酸为优级纯。

2方法

2.1粗多糖的制备醇沉法提取葡萄树伤流液中粗多糖，葡萄树伤流液在60℃下减压浓缩至原体积的1/20,得浓缩液，并向浓缩液中加入无水乙醇，使乙醇体积分数增加到20%(除微水溶性成分)，在4 ℃下静置12 h，离心分离(4 000 r·min-1，8 min)，留上清液储存，备用。继续在上述液体中添加无水乙醇，使无水乙醇体积分数提高至80%(用酒精比重计观察)，4 ℃下放置12 h，离心分离(4 000 r·min-1，8 min)，取产生的沉淀备用。沉淀分别用乙醇、丙酮、乙醚洗涤3次，用Sevage法除蛋白， 抽真空干燥后得粗多糖，供实验使用。

2.2多糖的分离纯化称取粗多糖5 g置于200 mL烧杯中，用100 mL温水溶解，离心分离(4 000 r·min-1，5 min)，取上清液，液体浓缩至40 mL，样品过DEAE-52纤维素柱进行分离，用蒸馏水洗脱后，用0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 mol·L-1的氯化钠溶液梯度洗脱，流速为1 mL·min-1，每管收集10 mL，用蒽酮、硫酸法跟踪检测，在621 nm处测定吸光度。收集同一浓度盐洗脱液至30～ 50 mL，用透析袋除盐， 用硝酸银(0.1 mol·L-1)检测是否将盐除尽。选择高浓度4个组分分别上SephedexG-150柱进一步洗脱，流速0.5 mL·min-1，收集多糖组分，浓缩，真空干燥后得较纯的8个多糖组分。

2.3单糖组成分析

2.3.1色谱条件检测器：氢火焰检测器；载气：N2；色谱柱：Rtx-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细管色谱柱；检测器温度为280 ℃；进样温度为235 ℃；H2：流速为40 mL·min-1；分流比为10∶1；尾吹250 mL·min-1；进样量:1.0 μL。

2.3.2单糖对照品的乙酰化分别精确称取干燥至恒质量Man、Rha、Glc、Gal、Xyl和Ara 10 mg单糖对照品于试管中，加入0.5 mL吡啶，用10 mg盐酸羟胺混匀后封管，90 ℃水浴中反应30 min，冷却至室温，加0.5 mL醋酸酐，混匀，封管，继续在90 ℃水浴中反应30 min，进行酰化反应，用氮气在60 ℃水浴中吹干，1.0 mL氯仿溶解，按2.3.1项下条件进行气相色谱分析(见图1)。

2.3.3样品的乙酰化分别取组分-1，组分-2，组分-3和组分-5各5 mg，置于试管中，加入2.0 mL 4.0 mol·L-1三氟乙酸，混匀，充氮气，封闭。在100 ℃水浴中加热水解12 h，水解完成后，在60 ℃水浴用氮气吹干，将得到的反应产物，加乙醇反复吹干除三氟乙酸，水解完成后的多糖按2.3.2项下方法将多糖进行乙酰化，再进行气相色谱分析。根据图2的出峰时间和峰面积确定多糖中单糖个数及其摩尔比。

3结果

3.1DEAE-52纤维素柱分离由DEAE-52洗脱可知，DEAE-52纤维素层析柱对葡萄树伤流液多糖的分离效果好，吐鲁番葡萄树伤流液多糖分离得到8个多糖组分，分别为水洗脱组分-1，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 mol·L-1氯化钠溶液洗脱组分2至组分8。

DEAE-52纤维素柱分离结果显示，水洗脱组分-1，氯化钠溶液洗脱组分-2，组分-3和组分-5中多糖含量较高，便于组成分析，因此，选用上述4种高含量多糖进行单糖组成分析，粗多糖的进一步纯化按2.2项下处理。

3.2SephadexG-150对多糖组分纯化结果DEAE-纤维素52分离纯化后得到的多糖组分-1、组分-2、组分-3、组分-5，并进行进一步分离纯化。经过DEAE-52纤维素柱分离后的各个组分再经SephadexG-150柱层析进行进一步分离，结果均显示单峰，说明这些组分较单一。收集所得各洗脱组分，水解处理后进行气相色谱分析，所得多糖的单糖组成见图1。通过单糖混合对照品气相色谱图(图1A)可以看出，单糖色谱峰间没有重叠，为葡萄树伤流液中多糖中组成单糖成分的分析奠定良好的基础。

图1多糖组分气相色谱图

A.单糖混合对照品；B.组分-1；C.组分-2；D.组分-3；E.组分-5；1.鼠李糖；2.阿拉伯糖；3.木糖；4.甘露糖；5.葡萄糖；6.半乳糖.

Fig.1Gas chromatogramsofpolysaccharide components

A.standard monosaccharide；B.component-1；C.component-2；D.component-3；E.component-5； 1.rhamnose；2. arabinose；3. xylose；4. mannose；5.glucose；6.galactose.

3.3单糖组成分析组分-1按峰高比大小依次排列为半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖、木糖；组分-2按峰高比大小依次排列为半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖、木糖，但峰高比值与组分-1相比稍低；组分-3按峰高比大小依次排列为半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖；组分-5按峰高比大小依次排列为半乳糖、甘露糖、葡萄糖、鼠李糖，其中葡萄糖的峰高比与甘露糖的峰高比几乎相等。

通过气相色谱数据，定量分析分离纯化所得吐鲁番木纳格葡萄树伤流多糖组分-1、组分-2、组分-3号、组分-5号的组成峰高比见表1。其中多糖中含量最低的单糖设峰高比为1。

表1吐鲁番葡萄树伤流液多糖的单糖组分气相色谱分析结果

Tab. 1 Monosaccharide composition of polysaccharides in Turpan grapes bleeding sap analyzed by GC

单糖RhaAraXylManGlcGal组分-13.34.21.01.72.05.0组分-21.62.11.01.32.32.9组分-32.22.1—1.01.92.5组分-51.0——1.21.11.4

注：—表示未含或微量测不出。

4讨论

本实验通过DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-150柱色谱，对吐鲁番葡萄树伤流液粗多糖进行分离纯化，得到相对分子质量较均匀的4个多糖组分，分别为组分-1、组分-2、组分-3、组分-5。使用气象色谱进行单糖组成分得知，多糖组分-1和组分-2是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，组分-1含量峰高比为3.3∶4.2∶1.0∶1.7∶2.0∶5.0，组分-2含量峰高比为1.6∶2.1∶1.0∶1.3∶2.3∶2.9。组分-3是由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，含量峰高比为2.2∶2.1∶1.0∶1.9∶2.5。组分-5由鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，其峰高比为1.0∶1.2∶1.1∶1.4。研究结果为今后开发、利用和评价天然资源提供了科学依据。

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