缬草黄酮纯化工艺研究

谷政伟+胡铁+黎继烈+李振海

摘要：为探讨缬草（Valeriana officinalis L.）黄酮纯化工艺，以树脂对黄酮的吸附率和解吸率为评价指标，通过静态吸附-解吸试验对6种树脂进行优选，在此基础上开展动态吸附-解吸试验，对上样与洗脱条件进行优化。结果表明，采用聚酰胺柱层析纯化缬草黄酮，在上样液浓度2.0 mg/mL、上样流速1.5 mL/min、上样量20.0 mL、上样液pH 5.5的条件下，用70.0%乙醇洗脱，洗脱流速2.0 mL/min、洗脱剂70.0 mL纯化3次，洗脱液经干燥、检测，发现黄酮纯度由粗品17.58%提高到79.17%。该工艺简单、安全、环保，可得到较高纯度的黄酮，适合纯化缬草黄酮。

关键词：缬草（Valeriana officinalis L.）；黄酮；纯化

中图分类号：S567.23+9；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）20-5336-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.042

Abstract：In order to investigate the purification process of flavonoids from Valeriana officinalis L.，the optimum resin was chosen from 6 kinds of resins by the static absorption-desorption tests and the adsorption and desorption rate of resins to flavonoids were used as index. Based on the above results，the sample and elution conditions were optimized by the dynamic absorption-desorption experiments. Flavonoids from Valeriana officinalis L. were purified by polyamide column chromatography and the optimum sample conditions were concentration 2.0 mg/mL，velocity 1.5 mL/min，amount 20.0 mL and pH value 5.5，the optimal elution conditions were ethanol concentration 70.0%，velocity 2.0 mL/min and amount 70.0 mL. Under the above conditions，the purity of flavonoids was from 17.58% up to 79.17% by three times purification. The above approach is appropriate to purify flavonoids from Valeriana officinalis L. for it is safe，friendly to environment，easy to operate and can gain flavonoids safely with high purity.

Key words：Valeriana officinalis L.； flavonoids； purification

缬草（Valeriana officinalis L.）系败酱科缬草属植物，有着悠久的药用历史[1]。研究表明，缬草含有黄酮、揮发油、生物碱和木脂素等[2]。黄酮广泛存在于植物中，具有多种活性，例如抗氧化、抑菌、抗肿瘤和护肝等，且无明显副作用，可应用于制药和食品加工等领域[3，4]。缬草黄酮粗提液中有大量的杂质，如蛋白质、糖类、脂肪及色素等，需纯化才能被更好地利用，如探讨生物活性、鉴定结构和研制制剂等。肖婷等[5]和郜红利等[6]采用大孔树脂HPD-600柱层析纯化蜘蛛香黄酮，谭斌[7]开展聚酰胺柱层析纯化宽叶缬草黄酮，目前尚未发现提纯缬草黄酮的报道，因此本研究利用柱层析对缬草黄酮进行纯化，结合静态与动态吸附-解吸试验，对工艺参数进行优化，以期获得较高纯度的黄酮，为缬草及黄酮的更深层次开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料 缬草叶采自湖南省林业科学院试验基地大棚，经中南林业科技大学蒋丽娟教授鉴定为缬草属植物缬草的叶。

1.1.2 试剂 D-101、AB-8、HPD-450A、HPD-600、NKA-9大孔树脂，天津南开大学树脂有限公司； 80-100目聚酰胺树脂，上海楷样生物技术有限公司；芦丁标准品，上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇、氢氧化钠、盐酸和冰醋酸等均为国产分析纯。

1.1.3 仪器 PyNN130745型微波萃取仪（美国培安公司）；V-5100型可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；层析柱（上海沪西分析仪器厂有限公司）；DHL-B型电脑定时恒流泵（上海沪西分析仪器厂有限公司）；RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；ZWY-2102C型立式全温振荡器（上海智诚分析仪器制造有限公司）；高速台式冷冻离心机（美国Beckman Coulter公司）。

1.2 方法

1.2.1 缬草叶预处理 缬草叶预处理按文献[8]中方法操作。

1.2.2 样品溶液的制备 在纤维素酶浓度1.9 U/mL、液料比21.5∶1（mL∶g，下同）、乙醇体积分数48.0%、提取温度45.0 ℃条件下，超声波辅助提取61.0 min，提取完毕收集提取液，抽滤去残渣，旋转蒸发浓缩至较小体积，冷冻干燥后加入适量蒸馏水并充分搅拌，超声波处理15 min，使其充分溶解，备用。

1.2.3 芦丁标准曲线的制作 标准曲线的制作参考文献[8]。

1.2.4 黄酮纯度的检测 按照文献[8]中方法检测干燥物中黄酮质量，按下式计算黄酮纯度。

黄酮纯度=干燥物中黄酮质量/干燥物质量×100%

1.2.5 树脂预处理 大孔树脂预处理：95.0%乙醇浸泡24.0 h并不断搅拌→按湿法装柱→95.0%乙醇洗至流出液与蒸馏水混合（1∶5）不出现白色混浊→蒸馏水洗至无醇味→2%NaOH浸泡2.0～4.0 h→蒸馏水洗至中性→5.0%HCl浸泡2.0～4.0 h→蒸馏水洗至中性，过滤后备用。聚酰胺树脂预处理：95.0%乙醇浸泡24.0 h并不断搅拌→按湿法装柱→95.0%乙醇洗至流出液加适量蒸馏水（1∶5）不出现白色混浊→蒸馏水洗至无醇味→2.0%NaOH浸泡2.0～4.0 h→蒸馏水洗至中性→10%醋酸浸泡2.0～4.0 h→蒸馏水洗至中性，过滤后备用。

1.2.6 树脂再生 大孔树脂再生：95.0%乙醇洗至流出液无色，之后按预处理方法用NaOH与盐酸处理即可。聚酰胺树脂再生：95.0%乙醇洗至流出液无色，之后按预处理方法用NaOH与醋酸处理即可。

1.2.7 静态吸附-解吸试验 取预处理好的树脂2.5 g，装入三角瓶，加入制备好的样品溶液25.0 mL（黄酮浓度0.5 mg/mL），密封后放入摇床（转速150 r/min），在30.0 ℃条件下振荡12.0 h，过滤，按“1.2.4”中方法检测滤液中黄酮浓度，按文献[9]中方法计算吸附量和吸附率。将上述吸附黄酮后的树脂用适量蒸馏水洗涤后裝入三角瓶，加入60.0 mL 70.0%乙醇，密封后放入摇床（转速150 r/min），30.0 ℃振荡12.0 h，过滤，检测滤液的黄酮浓度，按文献[9]中方法计算解吸率。

1.2.8 动态吸附-解吸试验 取树脂8.0 g→湿法装柱→样品溶液上柱→蒸馏水洗脱除杂→乙醇洗脱→收集洗脱液→减压浓缩→冷冻干燥。

2 结果与分析

2.1 静态吸附试验

2.1.1 树脂筛选 按“1.2.7”中方法考察树脂对缬草黄酮的静态吸附量、吸附率与解吸率，结果见表1。由表1可知，聚酰胺树脂对缬草黄酮的吸附量、吸附率和解吸率均高于其他树脂，因此，以聚酰胺树脂为缬草黄酮富集纯化的载体。

2.1.2 温度对聚酰胺树脂静态吸附性能的影响 其他吸附条件同“1.2.7”，设置温度分别为30.0、35.0、40.0、45.0、50.0、55.0 ℃，考察温度对聚酰胺树脂静态吸附性能的影响，结果见图1。由图1可知，随着温度升高，吸附率逐渐降低，这是因为聚酰胺树脂吸附黄酮是一个自发地放热过程，温度升高不利于吸附。

2.1.3 聚酰胺树脂的静态吸附动力学特性检测 其他吸附条件同“1.2.7”，设置振荡时间分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 h，考察聚酰胺树脂的静态动力学吸附曲线，结果见图2。由图2可知，聚酰胺树脂对缬草黄酮的吸附为快速平衡型，即在起始阶段吸附率增加较快，在4.0 h接近平衡，这是因为在吸附初始阶段，树脂表面与黄酮接触充分，有利于树脂对黄酮的吸附，随着时间延长，孔容的限制导致树脂对黄酮的吸附接近饱和，吸附率变化不明显。

2.2 动态吸附试验

2.2.1 上样液浓度对吸附率的影响 在上样量20.0 mL、上样流速2.0 mL/min条件下，设置上样液浓度分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mg/mL，按“1.2.8”中方法进行动态吸附试验，考察上样液浓度对吸附率的影响，结果见图3。由图3可知，随着上样液浓度的增加，吸附率逐渐减小，这是因为上样液黄酮浓度增大使黄酮分子在树脂内部的扩散能力降低，且浓度增加后，与黄酮竞争树脂吸附位点的杂质将增多，导致吸附率下降，因此确定2.0 mg/mL为最适上样液浓度。

2.2.2 上样量对吸附率的影响 在上样液浓度2.0 mg/mL、上样流速2.0 mL/min条件下，分别上样20.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0 mL，考察不同上样量对吸附率的影响，结果见图4。由图4可知，随着上样量的增加，吸附率逐渐降低，这是因为上样量越多，树脂对黄酮的吸附越接近饱和，为提高上样液利用率，选择20.0 mL为最佳上样量。

2.2.3 上样流速对吸附率的影响 在上样液浓度2.0 mg/mL、上样量20.0 mL条件下，分别以流速1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL/mim上样，考察不同上样流速对吸附率的影响，结果见图5。由图5可知，随着上样流速增加，吸附率逐渐降低，这可能是因为上样流速增大使上样液与树脂的接触时间减少，黄酮分子未被完全吸附即流出树脂柱，因此确定1.5 mL/min为最适上样流速。

2.2.4 上样液pH对吸附率的影响 在上样液浓度2.0 mg/mL、上样量20.0 mL、上样流速1.5 mL/min条件下，设置上样液pH分别为3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5，考察不同上样液pH对吸附率的影响，结果见图6。由图6可知，当pH在3.5～5.5，pH越大吸附率越高，pH超过5.5时，吸附率随着上样液pH的增大而降低，这是因为黄酮在强酸性条件下易形成“佯盐”；在偏碱性条件下易失去酚羟基H+，形成离子结构，影响树脂对黄酮的吸附，因此确定最适上样液pH为5.5（上样液本身pH 4.5）。

2.2.5 水洗脱用量的考察 聚酰胺树脂吸附黄酮后，用蒸馏水洗脱可除去多糖等杂质，也会对吸附的黄酮造成损失，因此以洗脱液中黄酮含量和多糖吸光度为主要指标优选水洗脱用量。依照已优化的条件上样，按每管10.0 mL收集水洗脱液，按“1.2.4”中方法检测每管洗脱液的黄酮浓度，采用苯酚-硫酸法于波长490.0 nm下检测多糖吸光度[10]，结果见表2。水洗脱除杂对黄酮造成的损失较小，第4管的多糖吸光度已接近零，因此确定最适水洗脱用量为40.0 mL。

2.3 动态解吸试验

2.3.1 洗脱剂体积分数对解吸率的影响 按已优化的条件上样和水洗脱除杂，在洗脱流速2.0 mL/min条件下，分别用60.0 mL的40.0%、50.0%、60.0%、70.0%、80.0%、90.0%乙醇洗脱，按“1.2.8”中方法进行动态吸附-解吸试验，考察不同洗脱剂体积分数对解吸率的影响，结果见图7。由图7可知，当洗脱剂体积分数在40.0%～70.0%，解吸率随着洗脱剂体积分数的增大而升高，当洗脱剂体积分数大于70.0%后，解吸率逐渐减小，因此确定70.0%为最适洗脱剂体积分数。

2.3.2 洗脱流速对解吸率的影响 在洗脱剂体积分数70.0%、洗脱剂量60.0 mL条件下，分别依照流速1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL/min进行洗脱，考察不同洗脱流速对解吸率的影响，结果见图8。由图8可知，当洗脱流速在1.5～2.0 mL/min，解吸率变化大不，当洗脱流速大于2.0 mL/min时，解吸率降低明显，这可能是因为洗脱流速过高导致洗脱剂不能很好地与树脂上吸附的黄酮进行交换，若洗脱流速过小，试验周期将延长[11]，因此确定2.0 mL/min为最适洗脱流速。

2.3.3 动态解吸曲线与洗脫剂量的考察 在洗脱剂浓度70.0%，洗脱流速2.0 mg/mL条件下，按每管5.0 mL收集洗脱液，依照“1.2.4”中方法检测每管洗脱液的黄酮浓度，结果见图9。由图9可知，从第1管到第6管，黄酮浓度逐渐上升，第6管后黄酮浓度逐渐下降，第14管黄酮浓度接近零，因此确定70.0 mL为最佳洗脱剂量。

在上样液浓度2.0 mg/mL、上样流速1.5 mL/min、上样量20.0 mL、上样液pH 5.5的条件下，用40.0 mL蒸馏水按流速1.5 mL/min洗脱后用70.0%乙醇洗脱，洗脱流速2.0 mL/min、洗脱剂量70.0 mL，按每管5.0 mL收集洗脱液，只保留第5、6、7、8、9这5 管洗脱液，浓缩后冷冻干燥。对冷冻干燥所得物再过2次聚酰胺柱，按“1.2.5”中方法对粗品、1次过柱所得物、2次过柱所得物、3次过柱所得物检测黄酮纯度，结果见表3。

3 小结

本试验通过考察6种树脂对缬草黄酮的静态吸附-解吸性能筛选出聚酰胺树脂，进行动态吸附-解吸试验，得到最优工艺：以流速1.5 mL/min加黄酮浓度2.0 mg/mL、pH 5.5的样品液20.0 mL，用40.0 mL蒸馏水以流速1.5 mL/min洗脱后用70.0 mL的70.0%乙醇按流速2.0 mL/min洗脱，经3次聚酰胺柱层析的缬草黄酮纯度由粗品17.58%提高到79.17%。

聚酰胺柱层析纯化缬草黄酮成本低廉，无金属和毒性溶剂残留，具有稳定可行和操作方便等优点，这可为用缬草和黄酮的进一步研究提供支持。

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