不同产地延龄草中延龄草总皂苷的含量测定

不同产地延龄草中延龄草总皂苷的含量测定

高昕1，黄仟照1，江雨霖1，孙卫1，屈钶楠1，孙文军2*

(1.西安交通大学药学院，西安710061；2.西安新通药物研究有限公司，西安710077)

摘要：目的建立延龄草中总皂苷的含量测定方法，比较研究不同产地延龄草中总皂苷的含量。方法以薯蓣皂苷元为对照品，采用分光光度法，高氯酸显色，在410 nm处测定吸光度，计算延龄草中总皂苷的含量。结果薯蓣皂苷元在4.12~49.44 μg范围内与吸光度值呈良好的线性关系(r=0.998 9)，平均回收率为97.3%，RSD为2.5%。结论该方法操作简便、准确、灵敏、重复性好，可用于延龄草样品中总皂苷的含量测定，不同产地样品，总皂苷含量有差异。

关键词：延龄草；总皂苷；薯蓣皂苷元；分光光度法

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.03.005

中图分类号：R284

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2015)03-0234-03

Abstract:ObjectiveTo establish a method for the determination and comparison of total saponins in Trillium tschonoskii Maxim from different origins. MethodsWith diosgenin as a reference substance, HClO4 as a coloration reagent, the content of total saponins in Trillium tschonoskii Maxim was determined at 410 nm by UV spectrophotometry. ResultsDiosgenin showed a good linear curve in the range of 4.12-49.44 μg (r=0.998 9). The recovery of total saponins was 97.3% with RSD 2.5%(n=6). Conclusion The method is simple, rapid and accuracy. The content of total saponins in Trillium tschonoskii Maxim varied in origins.

基金项目：中央高校基本科研业务费专项资助项目(编号.Xjj2012051);必康制药科研基金培育项目；西安交通大学新教师科研支持计划

作者简介：高昕，女，博士，讲师

收稿日期：(2014-12-17)

Determination of total saponins ofTrilliumtschonoskiiMaxim from different origins

GAO Xin1，HUANG Qianzhao1，JIANG Yulin1，SUN Wei1，QU Kenan1，SUN Wenjun2*(1.School of Pharmacy， Xi′an Jiaotong University， Xi′an 710061， China； 2. Information Department of Science and Technology， Xi′an Xintong Pharmaceutical Research Limited Company， Xi′an 710077，China)

Key words:TrilliumtschonoskiiMaxim； total saponins； diosgenin； spectrophotometry

*通信作者：孙文军，男，博士，助理研究员

延龄草又名头顶一颗珠、芋儿七，为百合科延龄草属植物延龄草(TrilliumtschonoskiiMaxim，TTM)的干燥根和根茎，主要分布在中国及日本，生长在海拔1 600～3 200 m的林下、山谷阴湿的环境下。在传统医学领域，内外妇儿皆有应用，尤其对一些疑难杂症，疗效显著，如：常年的高血压性眩晕、头痛，长期用脑的血虚、神经衰弱、失眠，脑震荡后遗症，血管性痴呆等。延龄草的相关研究多集中在20世纪80年代，主要为化学成分研究。近年来，由于发现其对老年痴呆、肿瘤、免疫调节等方面的作用[1-4]，对其的研究与开发日益受到重视。延龄草为国家三级重点保护野生植物，是珍稀濒危物种，人工培育等相关研究也取得了一定的进展，为资源的保护和开发提供了保证。研究表明，甾体皂苷是其主要成分，类型以偏诺皂苷和薯蓣皂苷为主，延龄草总皂苷已被证实具有抗肿瘤、抗老年痴呆等多方面的药理作用[5-6]。为了合理利用延龄草资源，本研究建立延龄草中总皂苷的含量测定方法，比较不同产地的延龄草中总皂苷的含量，为其质量控制及有效成分的综合开发和利用提供实验依据。

1仪器与试药

1.1仪器SCILOGEX台式高速离心机(美国SCILOGEX公司)；722N可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司)；Eppendorf Research® plus移液器(德国Eppendorf公司)；电子天平(常州万泰天平仪器有限公司)；RE-5299型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2试药延龄草药材来自陕西秦岭太白山、佛坪、河北、湖北、四川等地，经西安交通大学生药教研室牛晓峰教授鉴定为延龄草(TrilliumtschonoskiiMaxim.)的干燥根和根茎；薯蓣皂苷元对照品(美国Sigma公司)；水为蒸馏水；甲醇、乙醇、高氯酸、香草醛、冰醋酸等试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1对照品溶液的配制精密称取减压干燥至恒定质量的薯蓣皂苷元对照品20.6 mg，加甲醇适量溶解并定容至50 mL量瓶中，作为对照品母液，精密吸取适量于量瓶中，甲醇稀释，得到含薯蓣皂苷元0.041 2 mg·mL-1的对照品溶液。

2.2供试品溶液的制备精密称取延龄草药材粗粉，每份0.25 g，加入体积分数70%乙醇20 mL，回流提取2次，每次1 h，合并提取液，定容至50 mL量瓶中，作为供试品溶液。

2.3方法学考察

秀容川栽落草地，不动了。老砍头走上前，略一探查，发觉秀容川心不跳了，脉搏也停止了，再看他眼睛，两只瞳孔也散了。

2.3.1显色方法及波长的选择精密吸取对照品溶液和供试品溶液各0.5 mL各2份，分别置于10 mL具塞试管中，加热挥干溶剂，分别用2种显色剂显色，按照分光光度法于350~600 nm波长测定吸光度。比较供试品与对照品光谱在可见光区吸收图谱的一致性，确定最大吸收波长，并考察1 h内的稳定性。方法A：精密加入高氯酸5 mL，摇匀，置室温反应25 min，高氯酸为空白溶剂。方法 B：精密加入新配制的50 mg·mL-1香草醛冰乙酸溶液、高氯酸(2∶8)混合液5 mL，摇匀，置于60 ℃水浴中保温15 min，取出冰水迅速冷却至室温，加冰乙酸5 mL，混匀，显色剂为空白溶剂[7-8]。结果表明，用高氯酸作为显色剂，对照品溶液和供试品溶液在可见光区吸收波谱的一致性较好，且均在410 nm处有最大吸收，空白对照无干扰，故检测波长选择410 nm。见图1。

图12种显色方法的可见光吸收光谱图

A.高氯酸显色； B.香草醛冰乙酸溶液-高氯酸显色

Fig.1 Visible absorption spectra with two different coloration reagents

A.perchloric acid；B.Vanillin-ice acetic acid-perchloric acid

2.3.2标准曲线的绘制精密吸取对照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mL,分别置于10 mL具塞试管中，按2.3.1项下方法操作，于410 nm处测定吸光度(A)，以A为纵坐标，以对照品质量(μg)为横坐标，得回归方程：Y=0.019 3X-0.012 9(r=0.998 9)，线性范围4.12~49.44 μg。

2.3.3精密度实验精密吸取对照品溶液0.5 mL，按照2.3.1 项下方法显色，测定吸光度，连续测定5次，结果RSD为1.10%，说明仪器的精密度良好。

2.3.4稳定性实验精密吸取供试品溶液0.5 mL，按照2.3.1项下方法操作，于不同时间测定其吸光度值，放置5，15，30，60，90，120，180和1 440 min后，吸光度分别为0.495，0.494，0.495，0.501，0.506，0.508，0.512和0.539，RSD为1.48%。结果表明该方法在1 440 min内，溶液有较好的稳定性。

2.3.5重复性实验精密吸取延龄草提取液0.5 mL，6份，按照2.3.1项下方法操作，测定吸光度值，RSD为2.26%，表明该显色方法的重复性良好。

2.3.6加样回收率实验准确称取已知含量的延龄草药材干燥粗粉6份，每份0.125 g，加入薯蓣皂苷元适量，按照2.2项下方法制备样品溶液，各取0.5 mL样品液，按照2.3.1项下方法显色后测定吸光度，计算回收率，结果见表1。平均加样回收率为97.3%，RSD为2.5%。

表1回收率实验结果

Tab.1 Results of recovery rate by standard addition method

( n=6)

2.4.1提取方法的比较A浸渍法：精密称取延龄草药材干燥粗粉0.25 g，用乙醇20 mL浸渍24 h，时时振摇，滤过，滤液用乙醇定容。

B超声法：精密称取延龄草药材干燥粗粉0.25 g，用乙醇20 mL超声处理(功率250 W，频率33 kHz) 30 min，滤过，滤液用乙醇定容。

C加热回流法：精密称取延龄草药材干燥粗粉0.25 g，加入乙醇20 mL，回流提取1 h，滤过，滤液用乙醇定容。每个条件进行3个平行实验。

结果比较，取3种提取液，分别测定总皂苷含量(总皂苷含量=提取液中的总皂苷测得量/称样量×100%)。结果浸渍法、超声法和回流法样品中测得总皂苷含量分别为0.46%，0.89%和1.05%。可知3种提取方法中，加热回流法提取所得总皂苷的含量最高，超声法次之，浸渍法最低，故宜选用加热回流法对延龄草药材进行提取。

2.4.2提取溶媒考察精密称取延龄草药材粗粉15份，每份0.25 g，精密称定，分别用水、体积分数分别为30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和乙醇回流提取1 h，溶媒用量均为20 mL，滤液定容后，分别测定总皂苷含量。每个条件进行3个平行实验。结果上述不同提取溶媒的样品中测得总皂苷含量分别为0.30%，0.99%，0.92%，1.25%和1.04%。结果表明，用体积分数70%乙醇提取时延龄草总皂苷的得率最高，因此选择体积分数70%乙醇为提取溶媒。

2.4.3提取次数考察精密称取延龄草药材粗粉0.25 g，加入20 mL 体积分数70%乙醇回流提取1 h，分别提取1，2和3次，滤液合并浓缩，定容至50 mL。每个条件进行3个平行实验。分别测定总皂苷含量。结果上述提取次数的总皂苷含量分别为1.27%，1.56%和1.61%。从充分提取和操作时间上综合考虑，选择提取2次为最佳提取次数。

2.5延龄草样品中总皂苷含量测定精确称取不同产地的样品，各3份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.3.1项下方法显色后测定吸光度，由回归方程计算供试品延龄草中总皂苷的含量，测定结果见表2。

表2不同产地延龄草中总皂苷含量测定结果

Tab.2 Contents of total saponins inTrilliumtschonoskiiMaxim from different origins

产地批号总皂苷含量/%RSD/%陕西太白山区201310231.692.35陕西佛坪201310121.582.59湖北神农架201311291.371.87河北安国药材市场201312021.332.67四川荷花池药材市场201312161.253.14安徽亳州药材市场201206250.862.91江西樟树药材市场201212291.122.48

3讨论

为使样品中的总皂苷得到充分提取，首先对样品的制备方法进行了考察，分别比较了不同提取方法(冷浸、回流和超声提取法)，不同提取时间(1，2和3 h)和不同体积分数提取溶媒(水、体积分数30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和乙醇)对总皂苷含量的影响。实验结果表明，采用体积分数70%乙醇回流提取2次，每次1 h，可使药材中的总皂苷得到较充分地提取，而且提取方法简便易行，时间短，效率高。

本文比较研究了高氯酸及50 g·L-1香草醛-冰醋酸-高氯酸(2∶8)2种显色方法，结果显示，以高氯酸为显色剂，对照品和供试品的吸收波谱一致性和重复性较好。本研究还考察了实验过程中水浴加热对高氯酸显色的影响，结果表明，无论是室温放置25 min，还是加热至60 ℃反应后冷水浴充分冷却，吸光度值没有显著性差异，都可获得良好的重复性和稳定性。因此，选择室温放置反应的方式，显色稳定，操作简单，符合定量要求。

产地是中药质量的本草学属性，在中药质量评价中有着不可或缺的重要地位。优质药材的产地称为“道地”产区。延龄草在中国主要分布于陕西、湖北、四川、云南等地，为著名的陕西七药，民间应用较多，延龄草皂苷类成分是延龄草中重要的活性成分。实验结果发现，不同产区的延龄药材草中总皂苷含量不同，含量最高的为陕西太白山区的延龄草药材，含量最低的来自于安徽亳州药材市场。不同产区药材中延龄草皂苷的含量差异较大，这为深入研究和确定药材的道地产区提供科学依据，也为延龄草质量评价和质量控制标准的制定奠定基础。

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