五味余甘子散对大鼠心肌缺血再灌损伤Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

李元忠，谭国生，李福安，张得钧*

(1.青海省海东市乐都区中医院，青海 乐都 810799；2.青海大学医学院，青海 西宁 810001)

五味余甘子散对大鼠心肌缺血再灌损伤Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

李元忠1，谭国生2，李福安2，张得钧2*

(1.青海省海东市乐都区中医院，青海 乐都 810799；2.青海大学医学院，青海 西宁 810001)

摘要目的探讨藏方五味余甘子散对大鼠心肌缺血再灌损伤相关细胞凋亡蛋白表达的影响及其可能机理。方法96只SD大鼠随机分成6组，分别为五味余甘子散高、中、低剂量组，伪手术组，模型组以及阳性对照组，每组16只。用结扎大鼠左冠状动脉前降支法制备心肌缺血再灌注模型，再灌注40 min后，检测大鼠心肌细胞Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果五味余甘子散能显著提高心肌细胞Bcl-2蛋白的表达，抑制Bax蛋白的表达，同时提高Bcl-2/Bax比值。结论五味余甘子散对大鼠心肌缺血再灌损伤具有保护作用，其机制可能通过上调凋亡Bcl-2蛋白表达，提高Bcl-2/Bax比值，下调Bax蛋白的表达抑制细胞凋亡。

关键词五味余甘子散心肌缺血再灌注损伤Bcl-2 Bax

通信作者*：，博士，教授，E-mail：djzhang@ nwipb.ac.cn

※：李元忠(1975~)，男，汉族，青海籍，主治医师

中图分类号R932

文献标识码识码A

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.02.012

AbstractObjectiveTo explore the influence of apoptosis-associated protein expression and its possible mechanism of Wuwei Yuganzi San，one of Tibetan medicine，on myocardial ischemia-reperfusion injury in rats. Methods Ninety-six Sprague-Dawley rats were assigned randomly into six groups including high dose group，moderate dose group and low dose group according to the dosage of Wuwei Yuganzi San administrated.Moreover，Sham-operation group，Model group and Positive control group were supplemented.And each group was 16 rats，Myocardial ischemia-reperfusion injury model was established by ligation of the left anterior descending coronary artery(LAD)of the heart.Following 40 min reperfusion in rats，Bcl-2 and Bax protein expression in cardiomyocytes were detected.Results Myocardial Bcl-2 protein expression was significantly augmented well paralleling with an increase in ratio of Bcl-2 to Bax，while Bax protein expression was inhabited.Conclusion WuweiYuganzi San may have a protective effect on myocardial ischemia-reperfusion injury model.The mechanisms may associate with an up-regulated expression of Bcl-2，and an increased ratio of Bcl-2/Bax and a low-regulated expression of Bax，resulting in suppression of apoptosis.

KeywordsWuweiyuganzisanMyocardial ischemia-reperfusion injuryBcl-2 and Bax

收稿日期2015-01-03

THE INFLUENCE OF TIBETAN MEDICINE WUWEIYUGANZISAN

ON Bcl-2 AND Bax EXPRESSION IN MYOCARDIAL

ISCHEMIA-REPERFUSION INJURY IN RATS

Li Yuanzhong1，Tan Guosheng2，Li Fuan2，Zhang Dejun2

(1.Ledu Hospital of Traditional Chinese Medicine，Haidong，Qinghai，810799；

2.Qinghai University Medical College，Xining，Qinghai，810001)

心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)机制很多，细胞凋亡是缺血再灌注损伤心肌细胞死亡重要的形式之一[1]。近年来，对抗心肌缺血再灌注损伤凋亡的报道较多，但所述机制不一，且无相应解决方法。五味余甘子散化裁于《帝玛医著选集》[2]中“居如聂莪”方，其由余甘子、藏锦鸡儿等组成，临床应用效果明显，但缺乏相关应用依据。因此，本研究通过观测心肌缺血再灌注损伤后心肌组织中Bcl-2蛋白及Bax蛋白表达变化，来探讨五味余甘子散对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用机制。

1材料与方法

1.1　材料

1.1.1实验对象

清洁级SD大鼠，雌雄各半，体重180～220 g，共96只，购自甘肃中医学院科研实验中心，许可证号：SCXK(甘)2011-0001。

1.1.2药品及试剂

五味余甘子散(由青海省金诃藏药有限公司提供)，普萘洛尔(山西晋太药业，规格：10mg/片，批号：20110502)，氨基甲酸乙酯(国药集团化学试剂有限公司，批号：国药准字H14021523)；大鼠心肌凋亡Bc1-2及Bax蛋白试剂盒(20131113. 60284R)。

1.1.3主要实验仪器

YP601N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，星海Seastar旋转蒸发器(锡市星海五生化设备有限公司)，SHB-B型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，动物人工呼吸机(浙江医科大学仪器实验厂)，ML818 PowerLab生物信息信息采集系统(澳大利亚ADinstrument公司)，TDL50B飞鸽牌台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2　实验方法

1.2.1药物制备

将五味余甘子散各味药按一定比例配制，总量500 g，将诸药饮片稍加粉碎，混匀置砂锅中，加8倍药量蒸馏水，浸泡1 h后，先以武火煮沸，后用文火煎煮50 min后将药液倒出，再加约为药量4倍的蒸馏水再煎提一次，最后将两次煎提液充分混匀，四层纱布过滤，在旋转蒸发器(40℃～50℃，30r/min)中进行减压浓缩，浓缩至100%浓缩液，即1 mL浓缩液含生药1 g。将500 mL浓缩液按60 kg成人与200 g大鼠的剂量估算关系进行折算[3]，配成低、中、高三个剂量，分别为0.093、0.187、0.373 g/mL(分别为人的7、14、28倍剂量)；普萘洛尔浓度配成0.0013 g/mL，置于4 ℃冰箱备用。

1.2.2动物分组及给药

经1周适应性饲养，96只大鼠随机分成6组，分别为五味余甘子散高、中、低剂量组，伪手术组，模型组以及阳性对照组，每组16只，雌雄各半。五味余甘子散低、中、高组分别给予1.40、2.80、5.60 g/(kg·d)五味余甘子散，伪手术组及模型组分别给予相应浓度生理盐水，阳性对照组给予0.02 g/(kg·d)普萘洛尔，每日1次灌胃，连续灌胃10 d。

1.2.3动物模型制备

据相关文献[4]稍加改进，大鼠经称重后，以20%的氨基甲酸乙酯溶液(5mL/kg)行腹腔麻醉，固定，备皮，连接好Powerlab数据采集分析系统并记录正常心电图，于颏下颈部逐层钝性分离气管，甲状软骨下0.8 cm处，剪一倒置“T”型切口，进行气管插管，并连接动物呼吸机，调整呼吸频率至70次/min，潮气量15～20 mL/kg，呼吸比3：1，压力5～25 cm H2O。沿距胸骨左缘第三肋间0.8 cm处，用组织剪纵向剪开约2.5 cm(为第三肋至第六肋之间)切口，充分暴露胸腔，仔细将心包剥离，暴露心脏，于左心耳与肺动脉圆锥间处找到左冠状动脉主干，用棉签轻轻将左侧心脏托起，于左心耳下缘左冠脉左前降支1.5～2 mm处，用带5/0号丝线的无创眼科缝合针进针，深度为1～1.5 mm，宽度为2～3 mm，从肺动脉圆锥旁出针。将肝素化的聚乙烯管于结扎处与血管平行、贴壁放置，后结扎并关闭胸腔，观察心电图变化及心尖部颜色改变。以心电图QRS波增宽及J点抬高或降低超过三分之一稳定10 min以上、心尖部呈暗紫色为结扎成功标志。30 min后，将结扎线从聚乙烯管腔中剪断，缓慢拔出线头，再灌40 min，以心电图恢复、心尖部明显颜色改善为再灌注成功标志，否则给予剔除。伪手术组，只穿线而不结扎，30 min后将线拨出。

1.2.4标本采集及指标测定

造模结束后，摘取心脏，用4 ℃生理盐水冲洗血渍，滤纸吸干，迅速以液氮固定，固定好之后置于-80 ℃冰箱中保存备测。Bcl-2及Bax蛋白表达通过酶联免疫法测定。

1.2.5统计学处理

2结果

2.1　对心肌缺血再灌注大鼠心肌组织Bcl-2及Bax蛋白表达的影响(表1)

表1 五味余甘子散对心肌缺血再灌损伤大鼠心肌组织中Bcl-2及Bax蛋白表达的影响(±s)

Table 1 The effect of Wuwei Yuganzi San on rats myocardial tissue Bcl-2 and Bax expressions in MIRI(±s)

表1 五味余甘子散对心肌缺血再灌损伤大鼠心肌组织中Bcl-2及Bax蛋白表达的影响(±s)

组别例数(n)Bcl-2(%)Bax(%)Bcl-2/Bax比值伪手术组120.075±0.0150.077±0.0150.984±0.014模型组140.114±0.021☆0.311±0.017☆0.351±0.026☆普萘洛尔阳性对照组90.084±0.014△0.078±0.007△1.076±0.026△五味余甘子散低剂量组110.077±0.011△0.085±0.015△0.887±0.015☆△◇五味余甘子散中剂量组110.079±0.010△0.090±0.014△0.879±0.016☆△◇五味余甘子散高剂量组110.088±0.014△0.094±0.020△0.946±0.028△◇▼●F-12.292477.0521817.703P-<0.001<0.001<0.001

注：☆表示与伪手术组比较，P<0.05，△表示与模型组比较，P<0.05，◇表示与普萘洛尔阳性对照组比较，P<0.05，▼表示与五味余甘子散低剂量组比较，P<0.05，●表示与五味余甘子散中剂量组比较，P<0.05.

表1示，模型组与伪手术组比较，凋亡Bcl-2蛋白及相关Bax蛋白表达量升高(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值下降(P<0.01)，有显著性差异，表明缺血再灌注可引起Bcl-2、Bax蛋白表达上调。五味余甘子散各组与模型组比较，凋亡Bcl-2蛋白表达降低及Bax蛋白表达上调(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值升高(P<0.01)，有显著性差异，表明五味余甘子散干预心肌缺血再灌损伤有效；与阳性对照组比较(P<0.01)，无统计学差异，表明五味余甘子散干预作用与阳性药物相当；五味余甘子散各剂量组比较无统计学差异(P>0.01)，表明治疗效果与剂量无关。

3讨论

作为传统藏药藏方，五味余甘子散在藏医中用于治疗血热血瘀证，具有清热凉血、化瘀通脉的功效，临床应用于治疗心绞痛、高血压，高脂血症等疾病，尤其是心绞痛，疗效显著，但其作用机理不清。故本研究从细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达量角度探讨五味余甘子散对心肌缺血再灌注损伤的可能机制。

大量研究表明，MIRI的机理涉及到氧化应激、炎性反应、钙超载、坏死与凋亡[5-7]等，这些机制中一种或多种共同参与再灌注后的损伤。目前细胞凋亡被认为是心肌缺血再灌损伤的最终原因之一[8]。凋亡是一种细胞程序性死亡，主要有线粒体介导、死亡受体介导及内质网介导凋亡通路，其中对前两者研究较多，其具体的机理仍未完全阐明，但Bcl-2家族蛋白在线粒体介导的凋亡通路中起到关键作用，其分为Bcl-2、Bcl-XL等为主的抗凋亡调节蛋白，以及以Bax、Bak等为主的促凋亡调节蛋白[9]。抗凋亡蛋白Bcl-2位于线粒体膜上，防止线粒体释放细胞色素C，而促凋亡蛋白Bax位于细胞质中，可以诱导凋亡启动因子细胞色素C的释放，而细胞色素C与凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)结合并激活Caspase 9形成复合体，后者通过级联反应可分离并激活Caspase 3，从而启动凋亡程序或增强凋亡信号[10]。因此，Bcl-2与Bax是一个动态平衡体系，Bax蛋白过量表达则细胞凋亡处于促进状态，Bcl-2蛋白过量表达则细胞凋亡处于抑制状态，Bcl-2/Bax蛋白表达比率决定细胞凋亡发生是否[11，12]。在缺血或再灌注期间，Bcl-2与Bax的表达量，不管在促使和(或)阻止心肌细胞凋亡方面都起着关键作用。因此，Bcl-2、Bax蛋白表达量及Bcl-2/Bax蛋白表达量比值可以在一定程度上反映心肌细胞凋亡情况。本研究结果表明五味余甘子散各组可以上调Bcl-2蛋白、下调Bax蛋白表达以及升高Bcl-2/Bax表达量的比值，表明五味余甘子散可能通过上调Bcl-2的表达量、下调Bax的表达量，来抑制或阻断心肌缺血再灌注损伤的细胞凋亡的发生。

综上所述，五味余甘子散对心肌缺血再灌损伤具有保护作用，其可能的机理是通过上调抑制细胞凋亡相关蛋白Bcl-2及下调促细胞凋亡相关蛋白Bax来实现保护缺血再灌注后的心肌细胞。但由于心肌缺血再灌损伤的机制较为复杂，五味余甘子散对缺血再灌损伤的保护作用是直接作用还是间接作用，尚待进一步明确。

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