CA125在胃癌中的表达及c-Jun对CA125的调节机制

梁　宏，尹　宏，张晓岩，耿排力，谢　玮，李　叶

(1.青海大学医学院；2.第三军医大学新桥医院中心实验室；3.青海省第五人民医院)

梁宏(1982～)，男，汉族，山西籍，讲师

CA125在胃癌中的表达及c-Jun对CA125的调节机制

梁宏1，尹宏1，张晓岩1，耿排力1，谢玮2，李叶3

(1.青海大学医学院；2.第三军医大学新桥医院中心实验室；3.青海省第五人民医院)

摘要目的探讨糖类抗原CA125在胃癌中的表达差异，及在胃癌细胞中转录因子c-Jun对CA125的转录调节水平和可能的调控机制。方法(1)选取胃癌患者(恶性组)、健康体检者(正常对照组)的血清为研究对象。检测血清CA125含量差异，检测胃癌患者血清CA125含量水平，并分析其与临床各参数间关系。(2)在胃癌细胞株823和803中，敲低c-Jun的表达水平，利用蛋白印迹法及实时定量PCR分别检测、分析CA125的蛋白和核酸水平变化。(3)敲低c-Jun的表达水平，利用荧光素酶报告基因实验检测CA125的转录活性。结果CA125在胃癌组患者血清中的含量显著高于正常组(P<0.05)，单因素结果分析显示胃癌患者外周血中CA125含量与肿瘤的浸润深度、远处转移、淋巴转移相关(P<0.05)。同时，体外实验提示，敲低胃癌细胞803、823中c-Jun的表达，发现CA125的mRNA水平也随即下调(P<0.05)，但其蛋白水平并未受影响，而且通过荧光素酶报告基因实验发现，干扰c-Jun可显著抑制CA125基因启动子的转录活性，荧光素酶活性差异有统计学意义(P<0.05)。结论CA125作为一种肿瘤标记物在胃癌中的表达存在差异，其差异、转移等因素可能受细胞内转录因子c-Jun的调节。

关键词CA125胃癌c-Jun调节机制

中图分类号R273.261

文献标识码识码A

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.02.009

AbstractObjectiveTo investigate the different levels of carbohydrate antigen 125 expression in patients with gastric cancer and explore the regulating mechanisms of CA125 by the transcription factor c-Jun.Methods First of all，we detect the different levels of carbohydrate antigen 125 in 86 cases patients with gastric cancer in trial group and 80 healthy persons in control group.And then analyzed the correlation of it with different clinicopathological parameters in gastric cancer patients.Secondly，knock down the expression of c-Jun by siRNA，and detect the CA125 expression levels with Western blotting and Real time PCR in gastric cancer cells 803 and 823.At last，knocked down the c-Jun gene，and analyzed the regulating effect of c-Jun gene to CA125 transcription by Luciferase reporter assays.Results The expression level of CA125 was significantly higher in trial group than in control(P<0.05)and the CA125 expression levels were closely related with tumor invasions，distant metastasis and lymph node metastasis(P<0.05).Moreover，as the expression of c-Jun was knocked down in 823 and 803，the CA125 mRNA levels was down-regulated，but its protein levels showed no changes.Luciferase reporter assays proved that the CA125 transcription was restrained by CA125siRNA in cell lines(P<0.05).Conclusion The expression level of CA125 is significantly higher in gastric cancer.The c-Jun-mediated transcriptional regulation is one of the key factors for CA125 expression.CA125 is as one of tumor marker shows different expression in gastric cancer cells and it may be regulated by intracelullar trancription factor c-Jun .

KeywordsCA125Gastric cancerc-JunRegulatingMechanism

收稿日期2014-12-10

EXPRESSIONS OF CA125 IN PATIENTS WITH GASTRIC

CANCER AND THE REGULATORY MACHENISM OF

c-Jun TO CA125 IN GASTRIC CANCER CELLS

Liang Hong1，Yin Hong1，Zhang Xiaoyan1，Geng Paili1，Xie Wei2，Li Ye3

(1.Qinghai University Medical College；2.Xinqiao Hospital of The Third Military Medical University；

3.The fifth People′s Hospital of Qinghai Province)

恶性肿瘤的发生及发展是一个多因素、多基因、多步骤的综合过程。目前，国内外一部分学者通过检测肿瘤患者血清中基因来探讨。针对CA125而言，其在消化道肿瘤、前列腺肿瘤等不同肿瘤中的表达水平不一，但不具有特异性。因而需对CA125、CEA、CA199等行联合检测。本研究通过对肿瘤患者及正常人群临床资料的分析及相关检测，着重探讨CA125在胃癌中的表达差异，以及胃癌发生发展中，c-Jun对CA125的调节机制。以期为进一步研发针对c-Jun及CA125的靶向药物提供理论依据。

1材料与方法

1.1　临床资料选择

选取青海省人民医院及青海省第五人民医院2013年3月～2014年7月收治的胃癌患者86例；其中男56例，女30 例；年龄 27～67(42.4±11.3)岁。均由胃镜或术后病理证实为胃癌，其中粘液腺癌33例、腺癌53例(高分化、中分化腺癌27例，低分化腺癌26例)，选择同期在医院门诊健康体检者80例，其中男34例，平均年龄(55.54±10.37)岁，女46例，平均年龄(53.32±11.45)岁。入选标准：(1)未行内镜下姑息性切除；(2)胃癌患者为初治者，且未合并其他慢性病；(3)患者未行生物免疫治疗、放疗。

1.2　临床样本获取

(1)记录临床资料；(2)血清标本采集：被检查者禁食8～10 h，晨起时抽取肘静脉血5 mL，立即加入预冷的EDTA促凝管，静置2 h，离心(3000r/min)15 min分离血清，置-80 ℃冰箱待检。

1.3　CA125的检测及判断

应用罗氏Cobas C8000全自动生化分析仪检测。阳性标准分别为CA125>35 U/mL。

1.4　主要实验材料选择

人胃癌细胞株823、803细胞由本室保存；细胞培养所用6、24、96孔板和培养皿为Greiner Bio-one公司产品。F12和DMEM培养基购于Hyclone公司。RPIM1640、DMEM、胎牛血清为Gibco公司产品。

1.5　细胞培养

选取胃癌细胞株823、803，常规体外培养于10%灭活胎牛血清中(37℃， 5%的CO2)。

1.6　蛋白印迹检测

敲低细胞内c-Jun的蛋白水平，Western Blot 检测CA125的蛋白表达提取细胞总蛋白，每孔上样量为20 μg，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶电压100 V，分离胶电压为120 V。至溴酚蓝到达凝胶的最下缘时停止。切去浓缩胶后转膜。依次放置凝胶、硝酸纤维素膜及另两层滤纸及海棉垫，使硝酸纤维素膜朝向阳极，胶朝向阴极，夹紧塑料支架放入电泳槽内。接通电源，电流为150 mA，冰浴条件下电转移120 min。用5%脱脂奶粉(PBS配制)封闭硝酸纤维素膜，室温孵育2 h。CA125抗体(1：500)、GAPDH抗体(1：1000)滴到硝酸纤维素膜上，4 ℃过夜。PBS洗硝酸纤维素膜10遍，每次5 min；然后加入羊抗鼠IgG红外荧光二抗(1：20000)，室温置60 min， Tween-20/PBS洗5遍，每次10 min；最后用PBS冲洗一遍，暗室曝光。

1.7　细胞转染

敲低细胞内c-Jun的核酸水平：应用siRNA敲低细胞中的c-Jun，所用c-Jun-siRNA序列为GCAAAGAUGGAAACGACCUUCUAUGTT，control-siRNA序列为UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成，按照说明书使用lipofectamine2000转染细胞。

1.8　细胞系中CA125的核酸水平变化检测

细胞总RNA的提取和逆转录：按TRIZOL试剂说明书提取总RNA。按照逆转录试剂盒说明书(Imprim-ⅡTM，Promega)进行RNA的逆转录。

Real-Time PCR：设复孔，在PCR仪上进行扩增反应：94 ℃初始变性4 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，重复该循环40个，最后用2-△△CT对结果进行分析。

1.9　CA125的转录活性检测

荧光素酶报告基因实验：将c-Jun-siRNA及其空载pCMV与CA125-promoter质粒共转染至胃癌细胞株803、823中，利用Dual-Luciferase Reporter Assay System 检测转染细胞裂解液的荧光素酶活性。取15 μL细胞裂解液，加50 μL的LAR II试剂，混匀后测10 s的荧光计数，该计数反映了研究质粒报告基因表达萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)的活性水平。随后加入50 μL Stop&Glo试剂(Stop&Glo，淬灭萤火虫荧光，同时激发水母荧光)，混匀后测10 s的荧光计数，该计数反映了内参质粒pRL-SV40表达水母荧光素酶(Renilla luciferase)的活性水平。不同样品的荧光素酶相对活性用下述公式计算：相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性。

1.10　统计学处理

所用数据采用SPSS17.0统计软件处理，计量资料均用(±s)表示，阳性率的比较及单因素方差分析采用χ2检验，两组间的比较采用t检验，检验水准α=0.05。

2结果

2.1　两组血清中CA125 的含量

CA125在胃癌组患者血清中的含量显著高于正常组(P<0.05)， 见表1。

表1　两组血清中CA125的含量比较

2.2　胃癌患者血清中CA125的含量水平与其临床各种参数之间的关系

单因素结果分析显示胃癌患者外周血中CA125的含量与肿瘤的浸润深度、远处转移、淋巴转移相关(P<0.05)，而与年龄、性别、临床分期、组织学分型等无关(P>0.05)，见表2。

表2　胃癌患者血清中CA125的含量与其临床各参数之间的关系

续表：

2.3　胃癌细胞株中CA125蛋白水平的表达及干扰c-Jun对CA125的作用

分别提取胃癌细胞株823、803的总蛋白，检测CA125在蛋白水平上的表达，同时分别以GAPDH为Western blot的内参。实验结果显示：两种细胞株均有CA125的表达，且在蛋白水平c-Jun对CA125无调节作用，见图 1～2。

图1胃癌细胞株823图

Figure 1Gastric cancer cell strain 823

图2　胃癌细胞株803图

2.4　胃癌细胞株823、803中干扰c-Jun后CA125的核酸水平的表达

Real-Time PCR实验结果显示：两种细胞823及803，核酸水平c-Jun-siRNA对CA125起下调作用(P<0.05)，见表3。

表3　胃癌细胞株823、803中CA125的核酸含量(%)

注：★★与control比较P<0.05，★与control比较P<0.05.

2.5　CA125的转录活性

在胃癌细胞823及803中分别将c-Jun-siRNA及其空载pCMV与CA125-promoter 质粒共转染。结果表明，干扰c-Jun，显著抑制了CA125基因启动子的转录活性，荧光素酶活性差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4　胃癌细胞株823、803中CA125的转录活性相对值

注：★★与control比较P<0.05，★与control比较P<0.05.

3讨论

肿瘤标记物对胃恶性肿瘤的诊断和治疗多行多种大分子联合检测，尚未找到具有特异性及敏感性的单一肿瘤标记物[1]。但是综合国内外文献结果发现联合检测依然存在许多不足：(1)联合检测几种肿瘤标记物结果不是很一致，或者说敏感性不高；(2)联合检测的研究仅仅以揭示与某种肿瘤的关系为多，并未深入研究其在恶性肿瘤中的作用或者说影响。

糖类抗原CA125是一种类似黏蛋白的高分子多聚糖蛋白，在上皮性卵巢恶性肿瘤细胞中高度表达[2]。血清CA125是卵巢恶性肿瘤的首选标志物之一，目前已被广泛用于卵巢癌的早期诊断及术后监测[3]。国内外文献报道认为CA125的检测异常对在胃癌中的表达及敏感度也具有较为深远的意义。Nakata等[4]认为，CA125在胃癌患者血清中的表达水平与胃癌腹膜转移明显相关，Hwang等[5]认为，胃癌患者血清中CA125的水平诊断胃癌转移的特异度、灵敏度、准确度分别为98.4%、35.6%、91.5%。以上结果表明，CA125的表达水平在胃癌中也有很高的临床价值。国内学者也发现，血清中CA125的检测对胃癌腹膜转移也具有一定的意义[6]。

c-Jun主要介导一系列生理和病理刺激，包括应激、病毒感染等。对遗传修饰小鼠和细胞的研究表明c-Jun在正常发育和肿瘤转化过程中起重要作用[7-8]。

恶性肿瘤的发生及发展是一个多因素、多步骤的综合过程，这一观点已被国内外学者认可。但在某种肿瘤发生的过程中，深入研究一种标记物也意义深远。本研究通过收集我省胃癌患者及正常健康人群临床资料发现，CA125在胃癌组患者血清中的含量显著高于正常组(P<0.05)，单因素结果分析显示胃癌患者外周血中CA125的含量与肿瘤的浸润深度、远处转移、淋巴转移相关(P<0.05)，而与年龄、性别、临床分期、组织学分型等无关(P>0.05)。以上结论提示，CA125的表达可能在胃癌的侵袭及转移的过程中起到一个至关重要的作用，因此本研究充分利用分子生物学的手段在细胞株中进一步探讨c-Jun与之的内在关系。本研究结果提示，敲低胃癌细胞803、823中c-Jun的表达水平，发现CA125的mRNA水平也随即下调，但其蛋白水平并未受影响，而且通过荧光素酶报告基因实验发现干扰c-Jun，显著抑制了CA125基因启动子的转录活性，荧光素酶活性差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果表明，c-Jun对CA125的转录调节方面影响较大，且呈正相关趋势，而对蛋白方面的调节影响不大，说明CA125在蛋白水平的表达可能会受到其他中间体或者一些复合体大分子等的调节，本文不仅仅说明CA125作为一种肿瘤标记物对于胃癌的筛查具有重要的意义和可行性，且为进一步研究c-Jun和CA125在胃癌的发生、发展、转移中所起的作用提供新的思路。

参考文献

[1]吴葆华.癌胚抗原、糖类抗原125、糖类抗原50联合检测对老年胃癌的诊断价值[J].中国老年病杂志，2014，34(2)：525-526.

[2]李留霞，张兰兰.六种肿瘤相关抗原自身抗体联合CA125检测对卵巢癌早期诊断的价值[J].郑州大学学报(医学版)，2013，48(2)：238-241.

[3]Rustin GJ，Vergote I.Definitions for response and progression in ovarian cancer clinical trials incorporating RECIST 1.1 and CA125 agreed by the GCIG[J]，Int J Gynecol cancer，2011，21(2)：419-423.

[4]Nakata B，Hirakawa-YS.Serum CA 125 level as a predictor of peritioneal dissemination in patients with gastric carcinoma[J].cancer，1998，83(12)：2488-2492.

[5]Hwang GI，Yoo CH.predictive value of preoperative serum CEA，CA19-9，and CA125 levels for peritioneal in patients with gastric carcinoma[J].Cancer Res Treat，2004，36(3)：178-181.

[6]徐炜，卢敏，韩峰，等.联合检测诊断胃癌的诊断价值[J].山东医药，2009，49(19)：78-79.

[7]WeiXie，QinFeng.Transcriptional Regulation of PES1 Expression by c-Jun in Colon Cancer[J].plos one，2012，7(7)：1-11.

[8]Szabo E，Riffe ME，Steinberg SM，et al.Linnoila RI Altered cJUN expression：an early event in human lung carcinogenesis[J].Cancer Res，1996，56(2)：305-312.