新疆地区维吾尔族先天性心脏病患者CITED2基因突变分析

张为民 谭杰 阿布都沙拉木·吐尔逊 叶尔买克·唐沙尔汗 张总刚

临床研究

新疆地区维吾尔族先天性心脏病患者CITED2基因突变分析

张为民 谭杰 阿布都沙拉木·吐尔逊 叶尔买克·唐沙尔汗 张总刚

目的 分析新疆维吾尔族先天性心脏病（CHD）患者与CITED2基因突变的关系。方法 收集150例散发型维吾尔族CHD患者和150例健康维吾尔族人群血液样本进行DNA提取、目的基因聚合酶链反应及测序，与GeneBank进行比较以识别基因突变，并分析氨基酸序列。结果 一例室间隔缺损患者发现1个新的纯合突变c.574A>G，并导致相应氨基酸序列错义突变（p.Ser192Gly），该突变在CITED2基因丝氨酸-甘氨酸富含区，而在健康对照组中未发现此突变。结论 新疆维吾尔族CHD患者中首次发现了CITED2基因纯合突变，Serl92GIy突变所在序列呈现一定保守性，可能与CHD发生有关。

先天性心脏病； 基因； CITED2； 突变

先天性心脏病（congenital heart disease，CHD）是由于心脏、血管在胚胎期发育障碍所导致的形态、结构和功能异常，其发病率在活产婴儿中为6‰～8‰[1]。目前认为CHD是一种多基因遗传病，是胚胎时期遗传因素和环境因素共同作用的结果。心脏发育过程中单个或多个基因的突变及功能异常均可能导致心脏畸形的发生。CITED2（CBP/P300-interacting transactivator ED-rich 2）是转录辅助因子CITED家族中的重要一员，在心脏正常发育过程中起重要作用。研究发现，CITED 2敲除小鼠可伴有多种心脏畸形，在胚胎期即可死亡[2,3]。小鼠遗传基因与人类基因具有较高的同源性，提示CITED2突变可能是人类CHD发生的原因之一，国内外已有此方面的研究报道[4-10]。由于CHD具有显著的遗传异质性，有必要在不同种族人群中对CITED2基因进行研究。据此，本研究拟通过检测新疆地区维吾尔族CHD患者CITED2基因的编码序列，了解其在维吾尔CHD患者的突变情况，以探索CHD发生的病因。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2013年1月至2015年10月新疆自治区人民医院心外科收集新疆地区维吾尔族CHD患者150例（研究组），年龄3个月至60岁，其中男性68例、女性82例，中位年龄30岁；均经超声心动图和外科手术确诊。其中室间隔缺损（ventricular septal defect，VSD）39 例，房间隔缺损（atrial septal defect，ASD）101例，房间隔缺损合并室间隔缺损5例，动脉导管未闭（patent ductus ateriosus，PDA）3 例，肺动脉狭窄（pulmonary stenosis，PS）2例。同时收集150名体检正常维吾尔人作为对照组。所有研究对象无血缘关系。本研究征得研究对象/监护人知情同意，符合医学伦理学标准并得到新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 血液标本采集和基因组DNA提取 试验组及对照组均抽取外周血5 ml，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，使用基因组DNA抽提试剂盒（QIAGEN DNeasy Blood&Tissue Kit，天根生化科技北京有限公司）提取全血基因组DNA，-20℃存放备用。

1.2.2 聚合酶链式反应（PCR） 采用Primer 5.0软件设计引物，使扩增产物完全覆盖CITED2基因的不同区域。共设计1对引物，由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。引物PF5′-AGGCTGTTAGTGGGATCTTGG-3′，PR5′-TGGGTGAATGTCAAGGCTACA-3′，产物长度 1189 bp。20μl PCR反应体系中，基因组DNA 2μl，聚合酶链反应体系（Goldstar Best MasterMix北京康为世纪生物科技有限公司）10μl，水6μl。扩增条件：预变性95℃10 min，变性 95℃ 30 s，退火 64℃ 30 s，延伸 72℃ 90 s，35个循环，终延伸72℃ 10 min。所有PCR产物用琼脂糖凝胶电泳，EB染色，凝胶成像系统观察结果。

1.2.3 DNA测序及突变分析 所有PCR扩增产物均采用DNA胶回收试剂盒进行纯化，在ABI3730XL测序仪型全自动DNA序列分析仪上进行序列测定。将测序结果与NCBI的GenBank数据库中的CITED2基因标准序列（NM_006079.4）进行比对，以明确核苷酸变异的位点和类型。在国内外数据库检索有关CITED2基因文献，确定其变异是否是已报道突变或是新突变。

2 结果

2.1 PCR结果 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，病例组和对照组CITED2基因编码序列均扩增成功，见图1。

2.2 测序结果 将所有病例及对照样本的PCR产物进行测序，与基因数据库中的CITED2基因序列进行Blast比对。在CHD样本中检测到1例CITED2纯合突变，而正常对照样本中未检测到。病例为一例VSD患者，其编码链第574位碱基由A替换为G（c.574A＞G），引起192位氨基酸密码子由AGC变为GGC（图2），使相应氨基酸发生改变（p.Serl92G1y）而造成错义突变，导致蛋白结构发生相应改变。经文献检索查询发现此突变位点已有报道[6,9,10]，但均为此位点的杂合突变报道，此位点纯合突变报道尚数首次。

3 讨论

大量研究表明，CHD是环境因素和遗传因素共同作用的一种多基因遗传疾病。心脏发育是个极其复杂的动态过程，它涉及多个转录调控因子在胚胎发育过程中不同时间、不同空间的先后表达和相互作用。任何一个基因结构或量的异常均可导致心脏发育异常。近年来大量研究表明，CITED2基因在心脏和神经管发育等方面发挥着重要的调节作用[2,3]。尽管其功能尚未被完全揭示，但普遍认为它与心脏发育密切相关。

人类CITED2基因定位于染色体6q23.3，基因全长2390 bp，含有2个外显子和1个小内含子，编码链位于第2外显子，共编码270个氨基酸。Cited2基因序列的特点为：具有一个罕见的CpG（3 kb）岛；梭基末端具有一个由（CGG）n简单重复序列组成的特殊丝氨酸-甘氨酸富含区（serine-glycine richjunction，SGJ），该区对应的蛋白结构位于Ser161-G1y199；基末端包含长为 32个氨基酸（Asp224-Phe255）的CBP/p300结合序列。其独特的基因序列决定CITED2基因作为转录诱导因子，在胚胎发育和细胞增殖过程中能稳定传递，参与HIF-1、NF-kB、TFAP2等因子的转录过程，共同影响心脏结构的发育[2,11-13]。此外，CITED2可通过Nodal-Pitx2途径影响心脏左右对称体轴的形成[14]。Liu等[8]发现，CITED2基因突变可引起HIF1A的表达，导致与心脏发育有关的VEGF和PITX2C的表达下调，从而降低CITED2和TFAP2C反式激活PITX2C的协同作用。

动物实验表明，CITED2-/-小鼠在胚胎期死于多种心脏畸形，包括ASD、VSD、房室间隔缺损（atrioventricular，AVSD）、右心室双出口（double outlet right ventricle，DORV）、永存动脉干（persistent truncus arteriosus，PTA）、法洛四联症（Tetralogy of fallot，TOF）、大动脉转位（transposition of great arteries，TGA）、主动脉弓离断（interrupted aortic arch，IAA）、PS、右心房异构以及异常心袢的形成等[2,3]，表明该基因在小鼠胚胎心脏的发育中起重要作用。目前已在人类CHD患者中发现了数种CITED2基因突变，疾病表型为VSD和（或）ASD、TOF等[4-10]，与CITED2-/-敲除小鼠表现出多样的CHD表型相吻合。Sperling等[4]最早在392例CHD患儿中发现3种CHD的CITED2基因致病插入或缺失突变p.Serl70-Glyl78del、p.Gly178-Serf 79ins9 和 p.Serl 98-Glyl99de1，患者临床表型为VSD、ASD和肺静脉异位连接（anomalous pulmonary venous connection，APVC）。Chen等[7]在 1126例散发型 CHD 患者中发现 5个致病突变，p.Asn62Se、p.Arg92Gly、p.Thr166Asn、p.Ala187Thr 和 p.Gly180_Ala187del，患者临床表型 TOF、ASD、TGA、AVSD 和 PS。

国内有研究团队也在不同CHD患儿中发现了CITED2基因不同位点的突变。彭婷等[5]对101例CHD患儿进行筛查，1例PDA患儿被发现1种插入突变p.Serl61-G1y162ins。杨晓菲等[6]和Xu等[9]在120例CHD患儿中发现3个潜在CITED2致病突变 p.G1yl 84Ser、p.Serl92Gly、p.Serl92fs，患儿临床表型为镜面右位心伴TOF、主动脉瓣狭窄(aortic stenosis，AS)、AS 伴 PS。Liu 等[8]联合数家医院对700例CHD患儿进行筛查，发现5个潜在致病突变 ，p.Pro140Ser、p.Ser183Leu、p.Ser196G1y、p.Serl61 delAGC和p.Ser192_Gly 193delAGCGGC，患者临床表型为ASD、VSD、TOF。杨小萌等[10]对368例CHD患者进行筛查，发现2个潜在CITED2致病突变，p.Ser192Gly和p.Ser96Phe，患者临床表型为VSD和PDA。

本研究通过对150例维吾尔族CHD患者CITED2基因外显子序列的检测，仅1例VSD患者被发现有1种CITED2基因错义突变c.574A>G（p.Serl92Gly）。该位点突变为已有报道，临床表型为AS和VSD。该位点携带杂合A/G基因型者均患CHD，而对照人群携带纯合AA基因型，先前研究均未发现纯合GG基因型。我们发现的c.574A>G纯合突变报道尚数首次，p.Serl92Gly突变所在序列均呈现一定保守性。Sperling等[4]认为，SGJ区域的插入或缺失突变可能会导致该区域的蛋白构象发生变化，进而影响CITED2基因的CBP/p300结合结构域与CBP/p300或其他辅助因子的相互作用，最终导致心脏畸形的发生。本研究发现的突变位点p.Serl92Gly在SGJ区域对应的DNA序列，为SGJ是CHD的致病突变热点区域的观点进一步提供了临床依据。

国内外关于CHD患者CITED2基因编码区突变报道，仅在极少数病例中检测到CITED2基因编码区的突变。虽然很多学者认为CITED2基因的突变可能是CHD致病机制之一，仅从单纯基因突变不能完全解释基因与CHD的关系，还需要对其相关的遗传-环境共同作用机制进行深入研究。

（本文图片封三）

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Study of association between CITED2 gene mutation and congenital heart disease in Uygur patients in Xinjiang

ZHANG Wei-min＊，TAN Jie，Abudushalamu·Turxun，et al.＊Department of Cardiac Surgery，the People′s Hospital of the Xinjiang Uyghur Autonomous Region，Urumqi 830001，China

Objective To investigate the association of CITED2 gene mutation with congenital heart disease（CHD）in Uygur patients in Xinjiang.Methods The blood samples were collected from 150 Uygur patientswith sporadic CHD admitted in the People′s General Hospital of Xinjiang from January 2013 to October 2015.One hundred and fifty unrelated healthy Uygur individuals were used as controls.The coding region of CITED2 was amplified by PCR.The PCR products were sequenced and compared to GeneBank sequence databases.Results A homozygous A to G mutation was found in one patient with ventricular septal defect at nucleotide 574 in coding region of CITED2 gene，resulting in a missense mutation（p.Serl92Gly）which located in Serine-glycine rich junction（SGJ）region.Other patients and healthy individuals were normal.Conclusion The CITED2 gene homozygous mutation was first discovered in the Uygur CHD patients in Xinjiang，and the sequence of the mutation（p.Serl92Gly）was conservative，which may be one of the cause for CHD.

Congenital heart disease； Gene； CITED2； Mutation

ZHANG Wei-min，E-mail：xjourheart@163.com

新疆维吾尔自治区自然科学基金（项目编号：2014211A064）

830001 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市，新疆维吾尔自治区人民医院心外科（张为民、阿布都沙拉木·吐尔逊、叶尔买克·唐沙尔汗、张总刚），麻醉科（谭杰）

张为民，E-mail：xjourheart@163.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．11．010

R541.1

A

1672-5301（2016）11-0997-04

2016-07-18）