异丙酚对CO 2气腹后大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用及机制

异丙酚对CO2气腹后大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用及机制

邹海波，张巍丽，施鹏，孙晓峰

(沈阳医学院附属中心医院，沈阳110024)

摘要：目的观察异丙酚对CO2气腹后大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用，并探讨其作用机制。方法选择雄性大鼠48只，随机分为A、B、C、D组，每组12只。A、B、C组经尾静脉泵注生理盐水、D组经尾静脉泵注异丙酚。A组不做其他处理，B组经CO2气腹建立大鼠肺缺血模型，C、D组经CO2气腹建立大鼠肺血再灌注模型。各组造模后处死大鼠，取肺组织检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)，计算肺湿干质量比(W/D)，采用免疫组化法、Real-time PCR法、Western blotting法分别检测肺组织中HO-1阳性细胞数、蛋白表达及mRNA水平。结果B、C组SOD、MDA、W/D与A组比较差异有统计学意义(P均<0.05)，D组SOD、MDA、W/D与A组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。D组肺组织中HO-1蛋白表达阳性细胞数、蛋白相对表达量、mRNA相对表达量高于其他三组(P均<0.01)。结论 异丙酚在CO2气腹后大鼠肺脏血再灌注损伤中具有保护作用，其机制可能与HO-1表达增加有关。

关键词：肺缺血；再灌注损伤；异丙酚；二氧化碳气腹；大鼠

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.41.010

中图分类号：R563

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)41-0028-03

收稿日期：(2015-07-14)

腹腔镜在临床外科的应用越来越广泛，但CO2气腹带来的诸多不良反应也引起了关注。异丙酚作为一种临床麻醉常用药，具有抗氧化应激作用，其对肺缺血再灌注损伤的保护作用及其机制目前还存在争议[1]。2014年4月~2015年5月本实验以大鼠为实验对象，观察异丙酚在CO2气腹后大鼠肺缺血再灌注损伤中的保护作用，并探讨其作用机制。

1材料与方法

1.1动物分组及模型制备成年Wistar雄性大鼠48只,体质量280~320 g。将其随机分成A、B、C、D组4组，每组12只。实验前大鼠禁食12 h，自由饮水。参照Pringle法造模的麻醉剂量，10%水合氯醛(3 mL/kg)经大鼠腹腔麻醉。皮肤消毒后，腹部插入气腹针(压力20 mmHg)，剖开颈动脉，插管检测平均动脉压(MAP)。A组不做其他处理，仅尾静脉泵注生理盐水1 h(10 mL/kg)；B组在A组基础上给予气腹(压力20 mmHg)1 h；C组在A组基础上，气腹1 h后放开0.5 h；D组在C组基础上，用异丙酚代替生理盐水，经尾静脉泵注异丙酚1.5 h[10 mg/(kg·h)](异丙酚原液用生理盐水10倍稀释)，气腹(压力20 mmHg)1 h后放开0.5 h。各组于造模后即刻处死大鼠。

1.2肺组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)检测大鼠处死后取肺组织10 mg，置于液氮中冷冻。用硫代巴比妥酸比色法测定肺组织中MDA，黄嘌呤氧化酶法测定肺组织中SOD，均严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3肺湿干质量比(W/D)计算模型制备成功后处死大鼠，取右上肺叶称湿质量，置于80 ℃烘箱中烘烤48 h至恒重，取出后称干质量，计算肺W/D。

1.4肺组织中HO-1表达检测

1.4.1HO-1蛋白表达阳性细胞检测采用免疫组化法。处死大鼠后取右肺组织置于10%甲醛中固定，石蜡包埋，严格按照试剂盒说明书进行操作。光镜下观察，阳性细胞的细胞核染色为棕色，计数3个视野阳性细胞数，取平均值。

1.4.2HO-1蛋白半定量检测采用Western blotting法。取各组右肺组织10 mg，严格按照试剂盒说明书进行操作。以β-actin为内参，显影后曝光冲片，胶片经凝胶成像分析系统扫描、成像后测定单位吸光度，并将各组吸光度值分别与β-actin密度值相比得出HO-1蛋白相对表达量。

1.4.3HO-1 mRNA检测采用Real-time PCR法。取各组冻存肺组织50 mg，以TRIzol法匀浆后提取浆液中总RNA，应用紫外分光光度法测定其表达水平。取1 μg总RNA，严格按照Prime Script RT Master Mix试剂盒说明书的要求逆转录为cDNA，并置于-30 ℃保存，以目的基因与内参基因的差值作为目的基因的相对表达量。

1.5统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量资料用±s表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组肺组织SOD、MDA及W/D比较见表1。

表1　各组肺组织SOD、MDA及W/D比较( ± s)

表1　各组肺组织SOD、MDA及W/D比较( ± s)

组别nSOD(U/mg)MDA(nmol/mg)W/DA组12625.41±85.314.02±0.753.75±0.38B组12383.75±35.15*△3.15±0.73*△4.84±0.45*△C组12303.51±70.23*5.91±0.52*5.85±0.89*D组12474.57±101.283.65±1.434.11±0.61

注：与A组、D组比较，*P<0.05；与C组比较，△P<0.05。

2.2各组肺组织中HO-1蛋白表达阳性细胞计数经免疫组化法检测A、B、C、D组肺组织中HO-1蛋白表达阳性细胞数分别为(5±1)、(11±2)、(17±1)、(25±2)个。与A组比较，B、C组阳性细胞数增多(P均<0．05)；与B、C组比较，D组阳性细胞数增多 (P均<0.01)。

2.3各组肺组织中HO-1蛋白相对表达量A、B、C、D组HO-1蛋白相对表达水平分别为0.02±0.003、0.31±0.07、0.49±0.06、0.62±0.03；与A组比较，B、C组HO-1蛋白表达水平升高，且C组高于B组(P均<0.05);与B、C组比较，D组HO-1蛋白表达水平升高(P均<0.05)。

2.4各组肺组织中HO-1 mRNA水平A、B、C、D组肺组织中HO-1 mRNA的相对表达量分别为0.23±0.09、0.58±0.13、0.71±0.16、0.93±0.15；与A组比较，B、C组中HO-1 mRNA表达水平升高(P均<0．05)；与B、C组比较，D组HO-1 mRNA表达水平升高(P均<0.01)。

3讨论

腹腔镜CO2气腹后所产生的机体各个器官缺血再灌注损伤是当前研究的热点[2]。液体复苏可导致全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征,其中肺最易受累[3]。严重的肺缺血再灌注损伤是远期急慢性炎症反应的危险因素[4]，其特征性病理变化为：凋亡细胞以肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞为主[5]，肺毛细血管内皮细胞受损后，肺泡-毛细血管屏障功能障碍，使炎症细胞和炎性介质渗出，肺泡及肺泡间质水肿，组织细胞死亡[6、7]。肺缺血再灌注损伤是由缺血的直接损伤及钙离子超载、中性粒细胞活化[8]引发“呼吸爆发”，产生大量自由基和促炎症细胞因子、内皮细胞等多种因素介导的多脏器功能受损的复杂病理生理过程[9]。Kupffer细胞激活产生大量氧自由基(OFR)和炎症介质被公认为是缺血再灌注损伤早期最主要的致伤原因[10]。生理状态下，体内OFR的生成与清除处于动态平衡，但在某些病理状态下，如肺脏再灌注损伤时通过吞噬细胞系统、线粒体呼吸链、儿茶酚胺的自身氧化等途径产生大量OFR，OFR是缺血器官再灌注后致组织损伤最早、最重要的有害物质之一[11]。特别是肺缺血再灌注致大量OFR生成，可激活转录因子蛋白(NF-κB)，使炎症因子释放增多[12]。

MDA是OFR与细胞膜不饱和脂肪酸发生过氧化反应(LP)过程中毒性最大的过氧化产物(LPO)。由于LPO具有活性高、氧化性能强和极不稳定的特点，直接测定器官中的含量比较困难。MDA是自由基攻击生物膜引发的脂质LPO，其水平可反映脂质过氧化程度，间接地反映出细胞受自由基攻击和损伤的程度[13]。SOD是体内最主要的自由基清除剂，可清除OFR。在缺血再灌注过程中过氧化-抗氧化状态失衡时，LP呈病理性增强，抗氧化防御体系被严重破坏，自由基可以与细胞膜磷脂、蛋白质、核酸等反应，并进一步导致细胞的代谢功能发生障碍。当体内OFR生成增多时，SOD与超氧阴离子反应生成过氧化氢，再由过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶转变为水，从而清除自由基，保护细胞免受损伤。MDA和SOD的变化表明缺血和再灌注是两个不同的阶段，CO2气腹造成的缺血过程中对肺脏造成了损伤，当气腹压力解除后这种损伤不但没有停止反而继续加重，即再灌注损伤。在本次实验中，高气腹压力压迫大鼠肺门部血管造成肺组织缺血性损伤，此时大鼠肺组织内的MDA含量升高，SOD含量降低。当放开气腹后，肺组织经历了再灌注过程，但此时损伤不但未减轻反而由于再灌注继续加重，MDA显著升高，SOD显著降低，但是应用异丙酚后，MDA含量明显下降，SOD含量明显升高。可见，高气腹压对大鼠肺组织造成了缺血再灌注损伤，异丙酚对其具有保护性作用。

HO-1又称热休克蛋白32，是一种限速酶，正常生理情况下存在于多个脏器与组织中，表达较少。但在应激情况下HO-1的表达便会反应性的增强，以减少应激状态带来的损伤。HO-1可催化血红素生成一氧化碳、铁离子和胆绿素，在抗氧化应激、抗炎、抑制细胞凋亡等方面发挥重要作用；有研究结果表明，HO-1的保护作用还可能与减轻脂质LP、降低半胱氨酸蛋白酶活性以对抗细胞凋亡和肿瘤坏死因子水平有关。本研究结果证明，HO-1在A组、B组、C组、D组中的表达逐渐升高，特别是D组升高最为明显，也充分证明异丙酚在肺脏缺血再灌注损伤过程中，可通过诱导HO-1的表达而发挥对肺脏的保护作用。

丙泊酚用于止血带所致缺血再灌注损伤时，能减少OFR生成，减轻脂质过氧化。异丙酚的保护性作用的机制表现为：清除OFR，降低OFR水平，减轻脂质LP，增强体内SOD、谷胱甘肽过氧化物酶活性，减弱中性粒细胞“呼吸爆发”，稳定细胞膜。异丙酚可直接与自由基反应，生成2,6-二异丙基苯氧基团，使自由基灭活，清除体内OFR，使脂质LP减弱；增加NO的含量，改善微循环障碍。此外，异丙酚良好的脂溶性亦使其更容易积聚在细胞的脂质双分子层上，从而提高细胞抗氧化损伤的能力。很多实验也表明，异丙酚具有增强SOD活性的作用，异丙酚不但减少脂质过氧化产物MDA的产生而且还能保持自由基清除剂的活性。本研究结果显示，异丙酚可增加HO-1的蛋白表达，增强机体的抗氧化能力，降低OFR水平，纠正缺血再灌注损伤中过氧化-抗氧化失衡状态。另外，有研究表明，细胞内钙离子浓度的增高和线粒体钙超载能够通过激活钙调节蛋白依赖性激酶-13和卡配因而诱导细胞自噬[14]；缺血再灌注损伤发生后，MDA、LPO和NF-κB水平明显升高，可作为肺损伤炎症反应和肺损伤程度的指标[15]；异丙酚阻断细胞内钙超载，增加抗炎性细胞因子，减少促炎性细胞因子的产生，减少多巴胺积聚等也可能参与了异丙酚对肺的保护作用。因而，异丙酚可以通过增加HO-1蛋白的表达减轻大鼠的肺缺血再灌注的损伤。

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