大黄附子汤对重症急性胰腺炎大鼠肠黏膜上皮细胞及线粒体结构和功能的影响

康新 梁正凯 路晓光 杩奇 宋建博 王逸 刘杰 范治伟 宋轶 王鹏

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是在临床常见急腹症之一，常继发全身炎症反应综合征(systemic inflammatroy response syndrome，SIRS)、多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS),甚至多器官功能衰竭(multiple organ failure，MOF)，病情凶险且进展迅速、病死率高[1-2]。SAP后引发的肠屏障功能障碍所导致的肠源性感染和内毒素血症，是SIRS、MODS由可逆阶段向不可逆阶段发展的关键因素，也是SAP病死率高居不下的主要原因[3-4]。研究表明[5-8]，线粒体结构和功能紊乱会导致肠黏膜上皮细胞(intestinal epithelial cells，IEC)能量代谢障碍，继而使其消化、呼吸、分泌、屏障等功能受到严重损害；线粒体功能正常与否，直接影响IEC的存活情况。前期临床研究表明，传统中药方剂大黄附子汤可促进肠蠕动功能的恢复[9]。基础研究发现，大黄附子汤能通过升高SAP时IEC线粒体Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性，维持IEC及其线粒体的超微结构[10]。笔者从线粒体呼吸功能和能量代谢角度，进一步探讨大黄附子汤对SAP时IEC及其线粒体结构和功能的影响。

资料与方法

一、实验动物与分组

60只成年健康雄性SD大鼠，体重250～300 g，由大连医科大学动物实验中心提供。动物采用随机数字表法将大鼠分为：对照组、SAP组与大黄附子汤治疗组(大黄附子汤组)，每组20只。每组再按建模后时间(6、12、24、48 h)分为4个亚组(n=5)。在实验过程中，遵照中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》进行。动物实验经过大连大学附属中山医院伦理委员会批准。

二、药品与试剂

大黄附子汤：附子9 g(先煎，产地甘肃)、大黄9 g(后下，产地甘肃)、细辛3 g(产地辽宁)以常规水煎制成悬浊液，剂量为200 mL(大连大学附属中山医院药剂科)，置100 ℃水浴消毒80 min，冷却后置于4 ℃冰箱备用。戊巴比妥钠(国药集团化学试剂有限公司)，用无菌0.9%氯化钠溶液配置成2%戊巴比妥钠溶液4℃冷藏保存备用。动物细胞/组织高质纯化线粒体分离试剂盒(美国，GENMED公司)和纯化线粒体细胞色素C氧化酶(cytochrome c oxidase，CcO)活性测定试剂盒(美国，GENMED公司)。牛磺胆酸钠(美国，Sigma公司)，用无菌0.9%氯化钠溶液配置成5%牛磺胆酸钠，常温下现配现用。

三、动物模型制备

术前所有动物禁食12 h，采用2%戊巴比妥钠腹腔注射进行麻醉(1 mL/kg)。麻醉后，仰卧位固定于手术台上，术区备皮、常规消毒铺巾，于剑突下上腹正中做切口，切口长约3 cm，暴露肝下间隙，用1 mL注射器针头刺入胰胆管，并缓慢推注5%牛磺胆酸钠(0.1 mL/100 g)诱导SAP模型，拔出针头后，用无菌棉签轻压刺入点10 min，见胰腺组织出血坏死后，还纳肠袢，关腹。对照组开腹后，翻动胰腺和十二指肠数次后关腹。模型组和大黄附子汤组按上述诱导SAP模型法造模后0、15、30、45 h分别采用0.9%氯化钠溶液和大黄附子汤保留灌肠(10 mL/kg)，而对照组同时间点给予同体积0.9%氯化钠溶液灌肠。术后不限制大鼠活动，术后6 h禁食水，同时放置于温暖环境中(20℃～25℃)。实验设计见图1。

图1 实验流程示意图

四、检测标本采集

于术后6、12、24、48 h分别于大鼠左侧股静脉采血，4℃条件下离心(3 500 r/min，10 min)，取上清，-20℃保存，用于血清淀粉酶和内毒素含量测定。动物处死后，切取部分回肠用于分离纯化IEC线粒体、IEC线粒体三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)和线粒体CcO活性测定以及病理组织学观察。用无菌刀片刮取2 g回肠上皮黏膜组织，置于预冷50 mL离心管中，按照动物细胞高质纯化线粒体分离试剂盒说明分离与纯化IEC线粒体。

五、指标测定

1.血清淀粉酶：用全自动生化仪(57600-010，日立公司，日本)测定血清淀粉酶含量。

2.血清内毒素：按照内毒素检测试剂盒(天津一瑞生物工程有限公司)说明书进行操作，采用MB-80微生物快速动态检测系统检测血浆内毒素含量，由标准曲线自动计算出待测血清内毒素含量。

3.IEC线粒体ATP合成酶: 采用荧光素—荧光素酶发光法。反应体系有 HEPES缓冲液10 mM、 MgCl22.5 mM、 磷酸钾缓冲液5 mM、乙二胺四乙酸(EDTA)0.5 mM、0.5 M苹果酸/0.25 M谷氨酸、荧光素—荧光素酶18 μg，线粒体蛋白为50 μg，反应总体积为0.5 mL,pH 7.35～7.45 。记录以上体系中发光强度作为本底，加入二磷酸腺苷(ADP)4 μmoL以启动线粒体 ATP合成反应，记录发光强度。在不加线粒体及ADP的平行实验的反应体系中，加入(1 nmol)的ATP，记录发光强度作为ATP合成量的标定值(酶活力单位：nmol·min-1·mg-1pro)。

4.IEC线粒体CcO: 采用分光光度计法，依照试剂盒说明书进行操作。测定其在550 nm处的吸光度变化，根据测定结果来评估CcO活性。用U蛋白标示测定结果，细胞色素C氧化酶活性单位(U/mg)定义为：在25℃及pH7.0的情况下，每单位酶在单位时间内(每分钟)氧化1μmol细胞色素C。

5.肠病理组织学检查：取末端回肠，苏木精—伊红染色法(HE)染色后，在光镜100倍下观察病理组织学变化。采用小肠上皮损伤指数[11]评估小肠损伤变化。见表1。

表1 大鼠小肠上皮损伤指数分级标准

六、统计学分析

结 果

一、大黄附子汤对SAP大鼠血清中淀粉酶值的影响

与同时相点对照组结果相比，SAP组大鼠血清淀粉酶水平在12、24、48 h均增高，(P均<0.001)，6 h时血清淀粉酶增高，差异无统计学(P>0.05)。大黄附子汤组与SAP组比较，大鼠血清淀粉酶在24 h和48 h显著降低(P<0.01)。结果见图2。

注：与对照组比较：aP<0.001，与大黄附子汤组比较：bP<0.01

图2对照组、SPA组、大黄附子汤组大鼠血清淀粉酶水平的变化

二、大黄附子汤对SAP大鼠血清内毒素的影响

SAP后12、24、48 h大鼠血清内毒素水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；与SAP组相比，大黄附子汤组大鼠血清内毒素值在建模后24、48 h均有不同程度下降(P<0.01)。见图3。

注：与对照组比较：aP<0.01，与大黄附子汤组比较：bP<0.01

图3对照组、SPA组、大黄附子汤组大鼠血清内毒素水平的变化

三、大黄附子汤对SAP大鼠IEC线粒体ATP合成酶活性的影响：

与对照组比较，SAP后6、12、24、48 h IEC线粒体ATP合成酶活性降低且随病程推移呈递减趋势，差异均有统计学意义(P<0.001)；经大黄附子汤治疗后IEC线粒体ATP合成酶活性高于同时间点的SAP组(P<0.05)，原递减趋势也得以逆转。见图4。

注：与对照组比较：aP<0.001，与大黄附子汤组比较：bP<0.05

图4对照组、SPA组、大黄附子汤组大鼠IEC线粒体ATP合成酶活性的变化

四、大黄附子汤对SAP大鼠IEC线粒体CcO活性的影响

SAP组12、24、48 h线粒体CcO活性低于同时间点对照组的结果(P均<0.001)，并随病程的进展逐渐降低。与SAP组相比，大黄附子汤可增加SAP后24 h、48 h线粒体CcO活性，差异有统计学意义(P均<0.01)。见图5。

五、大黄附子汤对SAP大鼠小肠上皮损伤指数的影响

与对照组相比，SAP组12 h小肠上皮损伤指数开始升高(P<0.01)，24、48 h持续性升高(P均<0.001)。大黄附子汤组可显著降低SAP后48 h小肠上皮损伤指数(P<0.001)。见图6。

注：与对照组比较：aP<0.001，与大黄附子汤组比较：bP<0.01

图5对照组、SPA组、大黄附子汤组大鼠IEC线粒体CcO活性的变化

注：与对照组比较：aP<0.01，与大黄附子汤组比较：bP<0.001

图6对照组、SPA组、大黄附子汤组大鼠小肠上皮损伤指数

讨 论

SAP是一种起病急骤、病死率高、发病机制复杂的外科急腹症。肠道是发生SAP应激反应的靶器官之一，SAP常并发肠屏障功能障碍(intestinal barrier dysfunction，IBD)，肠道细菌、内毒素经受损的肠黏膜进入体循环而继发肠源性内毒素血症，诱发和加重SIRS和MODS，导致较高死亡率[12-14]。因此，SAP的高死亡率与肠道功能失常密切相关[15]。本研究发现，大鼠胰胆管注射5%牛磺胆酸钠后血清淀粉酶、内毒素均有显著增高；SAP后12 h小肠上皮损伤指数开始显著高于同时间点对照组，随后的24 h和48 h升高更为显著。这些结果均表明，牛磺胆酸钠在胰胆管注射诱发SAP的同时，小肠上皮也并发损伤。

IEC的生理功能失常或死亡，肠道机械屏障、生物屏障等功能就会出现障碍或消失。肠上皮细胞、潘氏细胞、杯状细胞、内分泌细胞和未分化细胞组成肠黏膜上皮细胞，肠道屏障功能在很大程度上取决于IEC的功能正常与否。如果IEC结构被破坏，肠道屏障功能随之消失，肠道就失去了它原有的隔离作用，使致病菌、毒素以及肠内物质可通过这些屏障进入血液循环。线粒体是细胞能量的产生中枢。机体内超过90%的氧在线粒体内被利用：通过氧化磷酸化转化为 ATP。故线粒体是细胞内呼吸作用和产生ATP的主要场所，是维护细胞生命的重要细胞器。线粒体的结构和功能紊乱会导致IEC能量代谢障碍，继而使其消化、呼吸、分泌、屏障等功能受到严重损害。且线粒体功能的正常与否，直接关系到IEC的存亡。

ATP作为最重要的能量分子在细胞的各种生理、病理过程中起着重要作用[16]。通常细胞在凋亡、坏死或处于一些毒性状态下，ATP合成酶水平会下降。ATP水平的下降表明线粒体的功能受损。线粒体呼吸链复合体起着电子传递和质子泵出的作用，将氧化底物的质子氧化还原势能转化为跨线粒体内膜的电势能，用于驱动ATP合成。ATP合成酶的主要功能是利用电势能催化ADP与磷酸分子(Pi)合成ATP。H+-ATP酶合成活性的降低，将影响这一过程的效率[17-18]。本实验结果显示，SAP后6 h、12 h、24 h和48 h IEC线粒体ATP合成酶活性呈递减趋势，表明SAP后IEC线粒体H+-ATP酶利用ΔP催化合成ATP的能力降低，细胞发生能量代谢障碍。CcO存在于真核生物的线粒体上，在线粒体表面参与呼吸氧化作用，是呼吸电子传递链的第4个中心酶复合物，在细胞呼吸中处于细胞色素系统的末端，把呼吸底物的电子经过细胞色素系统直接传递给分子态氧。作为线粒体外膜功能的生物标记，通过测定CcO活性变化，可衡量线粒体外膜的完整性、评估线粒体的损害程度。本研究结果显示，SAP后12、24、48 h大鼠IEC线粒体CcO活性较对照组逐渐降低，表明SAP时IEC外膜完整性被破坏、线粒体结构受损。因此，SAP可造成IEC线粒体结构改变，导致呼吸功能紊乱，进而ATP合成减少、CcO活性降低，最终致IEC死亡，肠屏障功能损害。

大黄附子汤源自汉代张仲景的《金匮要略》，由大黄、附子、细辛组成，含大黄素、乌头碱和细辛醚等有效成分，具有温里散寒，通便止痛之功效。现常用于治疗急性肠梗阻、胰腺炎、胆囊术后综合征等[9,19-20]。传统中医理论认为，大黄附子汤的通便作用是由大黄苦寒的药性引起泻下所致。现代药理学研究证实，大黄酸苷等成分具有刺激肠黏膜下神经丛，使肠蠕动亢进的作用[21]。方中附子大辛大热，温阳祛寒为君药，附子主要含有次乌头碱等多种生物碱，具有强心、升压、抗休克、抗缺氧、扩张外周血管、拮抗炎症反应的作用。佐药细辛辛散温通。方中大黄能佐制附子的毒性，细辛的主要成分细辛醚具有缓解乌头碱毒性的功效。因此，大黄附子汤中三药合用相反相成，共同奏效。大黄附子汤摒弃长期以来重症急性胰腺炎中药治疗以“峻下、寒凉”为主，单纯清热解毒、活血攻下的用药特点，转而“温下”为主，寒热并用，温补通下并施，通下而不伤阳气。路小光等研究表明，大黄附子汤保留灌肠能显著增加SAP患者肠鸣音，改善胃肠功能评分及APACHEII评分，此外大黄附子汤还可能降低SAP患者血浆DAO活性和D～乳酸水平，保护肠黏膜免受损伤，保护肠道完整性，明显降低肠壁通透性[9]。本研究从线粒体呼吸功能和能量代谢角度着手，研究了大黄附子汤对SAP大鼠线粒体ATP合成酶和CcO活性的影响。研究发现，大黄附子汤可显著增强IEC线粒体ATP合成酶活性和线粒体CcO活性，逆转SAP后大鼠IEC线粒体呼吸功能和能量代谢的下降。同时，本研究也提示，大黄附子汤显著降低SAP后48 h小肠上皮损伤指数，降低血清淀粉酶和内毒素含量，缓解SAP病情。吴丽等研究发现，大黄附子汤能减少SAP大鼠内毒素移位吸收，显著改善SAP大鼠肠道及胰腺的病理改变[22]。

综上所述，SAP后大鼠IEC线粒体ATP合成酶和CcO活性均显著下降，存在细胞能量代谢和呼吸功能障碍，大黄附子汤能通过增强大鼠IEC线粒体ATP合成酶和CcO活性，保护SAP后IEC的损伤，降低血清淀粉酶及内毒素含量，缓解SAP病情。

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