人C型凝集素受体dectin-1单克隆抗体的制备

·论著·

人C型凝集素受体dectin-1单克隆抗体的制备

杨龙1，王英2，朱乐乐3，姜远英1*，贾鑫明3*

(1.第二军医大学药学院新药研究中心，上海 200433；2.第二军医大学长海医院皮肤科，上海 200433；3.同济大学医学院免疫学教研室，上海 200092)

[摘要]目的：克隆获得并原核表达人dectin-1基因的胞外段，以其作为抗原，制备人C型凝集素受体dectin-1的单克隆抗体。方法和结果：利用RT-PCR技术从人的外周血中克隆获得人dectin-1基因，克隆到pCDNA 3.0(+)载体中，获得pCDNA3.0(+)-dectin-1质粒。将dectin-1胞外段[dectin-1 (202 bp-744 bp)]克隆到pET28a(+)载体，构建原核表达质粒pET28a(+)-dectin-1(202 bp-744 bp)，转到大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)中，IPTG诱导目的片段原核表达，得到高效表达的dectin-1(202 bp-744 bp)，镍柱亲和层析纯化后免疫BALB/c小鼠，取抗体滴度高的小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，获得15株阳性杂交瘤细胞株，利用有限稀释法进行单克隆杂交瘤细胞株的筛选，获得5株单克隆细胞株。用单克隆细胞株制备小鼠腹水模型，经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化获得dectin-1的单克隆抗体。经蛋白质印迹法验证，此单克隆抗体能有效地识别人和小鼠的dectin-1蛋白。结论：成功制备获得dectin-1蛋白的特异、高效的单克隆抗体。

[关键词]C型凝集素受体；dectin-1；单克隆抗体

[中图分类号]R392.5，R967[文献标志码]A

DOI：10.5428/pcar20150204

基金项目上海市科学技术委员会科研基金(12JC1408400)

作者简介杨龙(男)，硕士生.

[收稿日期]2014-05-05

Preparation of monoclonal antibody of human C-type lectin receptors dectin-1

YANG Long1，WANG Ying2，ZHU LeLe3，JIANG YuanYing1*，JIA XinMing3*(1.New Drug Reseach and Development Center，School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai 200433,China；2. Department of Dermatology，Changhai Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China；3. Department of Immunology，School of Medicine，Tongji University，Shanghai 200092,China)

ABSTRACT[]Objective：To clone and prokaryoticly express the extracellular region of human C-type lectin receptor dectin-1 and prepare monoclonal antibodies of human dectin-1. Methods and Results：The full-length human dectin-1 mRNA was cloned from peripheral blood monocytes by using RT-PCR and inserted into the pCDNA3.0(+) vector. The extracellular region of dectin-1[dectin-1 (202 bp-744 bp)] was cloned and inserted into pET28a(+) vector to get pET28a(+)-dectin-1 (202 bp-744 bp) vector. The recombinant pET28a-dectin-1 (202 bp-744 bp) vector was transformed into E.coli BL21 (DE3). The expression of objective protein was high when induced with IPTG. The objective protein was purified with Ni-NTA affinity chromatograph and was used to immunize BALB/c mice. The mice which generated higher titer of antibody in the serum were sacrificed.The splenocytes were separated and fused with SP2/0 cells to generate hybridoma cells. Fifteen strains of hybridoma cells were thus obtained. After further selection and cloning，5 strains of monoclonal hybridoma cells secreting monoclonal antibodies against dectin-1 were established. BALB/c mice was intraperitoneally injected into hybridoma cells to produce ascites. The dectin-1 monoclonal antibody was purified by standard protocol of octanoic acid-ammonium sulfate precipitation，which could specifically combine to dectin-1，no matter whether they were human dectin-1 or mouse dectin-1,when used in Western blotting. Conclusion：The specific monoclonal antibodies against dectin-1 were successfully obtained.

[KEY WORDS]C-type lectin receptor;dectin-1;monoclonal antibody

[Pharm Care Res，2015，15(2)：95-98,146]

E-mail：muyi53@163.com

*通信作者(Corresponding author)：姜远英，E-mail：jiangyy@smmu.edu.cn；贾鑫明，E-mail：jiaxm@tongji.edu.cn

C 型凝集素受体(C-type lectin receptor，CLR)是一类重要的模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)，主要配体是糖成分。由于真菌细胞壁中含有大量的糖，所以CLR在抗真菌免疫中发挥重要作用[1]。Dectin-1(dendritic cell-associated C-type lectin-1)属于CLR超家族中的dectin-1亚家族，是研究最为广泛的一种C型凝集素受体，在抗真菌固有免疫应答中发挥重要作用[2]。Dectin-1基因位于人12号染色体(小鼠6号染色体)NKC(natural killer-gene complex)的端粒区[3]，其基因结构在人和小鼠中高度保守，氨基酸同源性为73.9%。Dectin-1主要表达在树突状细胞和巨噬细胞等固有免疫细胞表面，dectin-1为Ⅱ型糖蛋白，其结构包括胞质区免疫受体酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)、跨膜区和胞外区碳水化合物识别结构域(carbohydrate recognization domain，CRD)[4]。Dectin-1结合白念珠菌细胞壁分子β-glucan后，通过激活胞内的ITAM，募集激活Syk激酶，诱导CARD9/Bcl10/MALT1形成复合体，进而激活NF-κB，表达TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎细胞因子，启动机体的抗真菌感染固有免疫应答，并介导适应性免疫应答[5-8]。本研究通过克隆dectin-1胞外区序列并进行原核表达，以纯化的dectin-1胞外段蛋白为抗原免疫小鼠，筛选获得特异性分泌dectin-1抗体的单克隆杂交瘤细胞，制备功能性的抗dectin-1的单克隆抗体，为进一步研究dectin-1的生物学功能提供有效的工具。

1材料

1.1细胞株和实验动物小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0由第二军医大学药学院新药研究中心实验室保存；6周龄BALB/c小鼠购自中国科学院上海实验动物中心，动物生产合格证号：SCXK(沪)2012-0002；质粒 pET28a (+)、pCDNA3.0及菌株E.coliDH5α与E.coliBL21(DE3)由本实验室保存。

1.2主要试剂和器材RPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)、丙酮酸钠、青霉素、链霉素、卡那霉素、trizol等，均购自Life Technologies公司；RNA反转录试剂盒购自Promega公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT、HT、聚乙二醇(PEG)等均购自Sigma公司；HRP标记的羊抗鼠IgG购自北京康为世纪公司；高结合力酶标板购自Novagen公司；Galaxy 170 S CO2细胞培养箱购自德国Eppendorf公司；iMARK多功能酶标仪购自Bio-Rad公司。PCR引物(见表1)由铂尚公司合成。

2方法和结果

2.1pCDNA3.0(+)-dectin-1和pET28a(+)-dectin-1(202 bp-744 bp)重组表达质粒的构建与鉴定利用trizol方法抽提人外周血RNA，按照Promega公司的RNA反转录试剂盒的操作步骤将抽提的RNA反转录成cDNA，以其为模板利用PCR技术扩增(扩增条件为：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存)，获得人全长的dectin-1基因，见图1A。用BamHⅠ和XholⅠ双酶切上述的dectin-1 基因和载体质粒pcDNA3.1(+)，T4 DNA连接酶连接获得dectin-1-pcDNA3.1(+)质粒。再以pCDNA 3.0(+)-dectin-1质粒为模板，设计引物进行PCR，获得dectin-1基因胞外段[dectin-1(202 bp-744 bp)]，见图1B。用BamHⅠ和XholⅠ双酶切上述dectin-1(202 bp-744 bp)和载体质粒 pET28a(+)；T4 DNA连接酶连接，获得pET28a(+)-dectin-1(202 bp-744 bp)质粒，见图1C。挑取单克隆进行酶切鉴定及测序，测序结果与PubMed中的dectin-1基因(Gene ID:64581，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/64581)的序列完全相同，表明将dectin-1(202 bp-744 bp)成功克隆到pET28a(+)质粒中。

表1　引物列表

注：下划线表示酶切位点

图1　人dectin-1，dectin-1(202 bp-744 bp)及pET28a(+)-dectin-1(202 bp-744 bp)质粒 Figure 1　Human dectin-1，dectin-1 (202 bp-744 bp) and pET28a(+)-dectin-1(202 bp-744 bp) plasmids A：dectin-1；B：dectin-1 (202 bp-744 bp)，M：Marker，1：dectin-1 (202 bp-744 bp)；C：pET28a(+)-dectin-1 (202 bp-744 bp)，M：Marker，1-9：9个不同的pET28a(+)-dectin-1 (202 bp-744 bp)

2.2Dectin-1胞外段蛋白的原核表达和纯化将经鉴定的重组质粒pET28a(+) -dectin-1(202 bp-744 bp)转化至E.coliBL21(DE3)中，取阳性单克隆接种于5 ml含卡那霉素的新鲜LB培养基中，37 ℃振荡培养过夜；次日取2 ml上述菌液于40 ml新鲜LB中培养，加入终浓度为0.3 mmol/L的异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)，26 ℃诱导10 h，4 ℃，15 805×g离心3 min。收集细菌，用PBS洗涤3次，再重悬于10 ml PBS中，超声波裂解，10 976×g离心30 min。取80 μl上清液与20 μl的5×loading buffer，混匀，100 ℃金属浴5 min；同时向沉淀中加入5 ml PBS(含6 mol/L尿素)，混匀，3951×g离心5 min后取80 μl上清液与20 μl的5×loading buffer混匀，100 ℃金属浴5 min。分别将收集的上清液和沉淀的样品进行SDS-PAGE 电泳，进行考马斯亮蓝染色和脱色，结果显示目的片段[dectin-1 (202 bp-744 bp)]约17 ku，目的条带主要在沉淀部分，说明以包涵体形式表达(图2A-5)。取沉淀变性，用Ni-NTA His亲和层析柱纯化后复性，将获得组分进行SDS-PAGE 电泳，考马斯亮蓝染色检测，显示获得高纯度蛋白(图2B)。

图2　Dectin-1胞外段重组蛋白诱导表达 及纯化的SDS-PAGE电泳图 Figure 2　SDS-PAGE electrophorograms of expression products and purified dectin-1 recombinant extracellular region protein A：Dectin-1胞外段重组蛋白诱导表达SDS-PAGE电泳图；B：Dectin-1胞外段重组蛋白纯化后SDS-PAGE电泳图；M：Marker；1：没有转化质粒的E.coli BL21；2：转化pET28a(+)-dectin-1(202 bp- 744 bp)质粒的E.coli BL21；3：0.3 mmol/L IPTG诱导3 h的E. coli BL21；4：0.3 mmol/L IPTG诱导 10 h E.coli BL21 上清液； 5：0.3 mmol/L IPTG诱导10 h E.coli BL21沉淀； 6：纯化后的 dectin-1胞外段蛋白；IPTG：异丙基-β-D-半乳糖苷

2.3小鼠免疫和血清抗体滴度的测定取6周龄BALB/c小鼠3只，皮下注射纯化后的抗原蛋白50 μg/只(根据蛋白质浓度不同，体积不同)与等体积弗氏完全佐剂混匀的乳化物免疫小鼠；间隔2周后，皮下注射抗原蛋白(50 μg/只)与等体积弗氏不完全佐剂混匀的乳化物免疫小鼠，共5次(间隔均是2周)。最后1次免疫后第10天(d 10)测定小鼠血清抗体滴度。小鼠尾部取血，4 ℃静置过夜，1756×g离心10 min。收集上清液，并做1/500、1/1000、1/2000、1/4000、1/8000、1/16 000、1/32 000、1/64 000梯度稀释。各取100 μl加入酶标板中，4 ℃孵育过夜；PBST洗板后加入HRP标记的羊抗小鼠二抗(1∶5000稀释)，37 ℃孵育1 h；洗涤后加入TMB显色液，显色至适当颜色后用终止液进行终止反应，并用酶标仪在450 nm波长处读取吸光度值。

如图3A所示，2号小鼠血清中抗体效价较高。用3只小鼠的血清检测抗原蛋白，蛋白质印迹法结果显示，3只小鼠血清都可特异性地结合抗原蛋白，2号和3号小鼠血清结合较好(图3B)。故选择2号小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0 按5∶1的比例进行融合，建立杂交瘤细胞株。

图3　Dectin-1免疫小鼠血清抗体测定 Figure 3　Identification of dectin-1 antibodies (mouse serum) activity A：Elisa法检测dectin-1血清抗体滴度；B：蛋白质印迹法 检测dectin-1血清抗体的结合活性； ○：m1； ●：m2； △：m3

2.4Dectin-1杂交瘤细胞单克隆的筛选、鉴定选择免疫效果最好的2号小鼠做杂交瘤融合。最后一次免疫2周后，2号小鼠腹腔注射抗原蛋白50 μg(不加佐剂)，进行加强免疫。腹腔注射后d 4摘眼球取血，处死动物，取脾脏，分离脾细胞，按照常规操作步骤将脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0融合。用HAT选择性培养基对融合细胞进行筛选，建立杂交瘤细胞株，并用间接Elisa法检测细胞上清液中抗体效价，将强阳性细胞克隆化。随后用有限稀释法进行亚克隆筛选，若一个单克隆连续2～3次亚克隆，得到的所有克隆均为阳性时，可认定该单克隆细胞能稳定分泌特异性抗体，将该细胞建株，扩增保存或供制备小鼠腹水用。初步筛选结果如图4A所示，获得15株dectin-1阳性杂交瘤细胞，其中有6株单克隆细胞上清在450 nm处吸光度值较高，提示具有较高效价，对其进行蛋白质印迹检测，结果显示有5株单克隆细胞上清液与抗原蛋白结合较高(图4B)。

图4　分泌dectin-1抗体的杂交瘤细胞筛选鉴定 Figure 4　Selection of hybridomas secreting dectin-1 antibody A：Elisa法检测单克隆杂交瘤细胞上清液中抗体滴度；B：蛋白质 印迹法检测5株单克隆杂交瘤细胞上清液与抗原蛋白的结合 能力；-：未免疫小鼠血清；+：抗原免疫小鼠阳性血清

2.5小鼠腹水制备、抗体纯化、小鼠单克隆抗体的鉴定选取3株单克隆细胞株制备小鼠腹水。另取6周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5 ml 弗氏不完全佐剂免疫，10 d后将经筛选能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株以2×105个/只的量进行腹腔注射。腹腔注射杂交瘤细胞株后14 d抽取腹水，用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化获得dectin-1(202 bp-774 bp)的单克隆抗体，4 ℃透析过夜后测定抗体浓度，并保存待鉴定。

用蛋白质印迹法检测dectin-1抗体的特异性反应性。文献报道dectin-1参与真菌的识别，并可以被诱导而致高表达[9]，故提取1例真菌感染病人单核细胞和骨髓细胞的总蛋白，1例健康志愿者的外周血单核细胞的总蛋白。蛋白质印迹法显示，3株单克隆抗体都能与人dectin-1蛋白特异性结合，图5A-1、图5A-2、图5A-3分别显示3株单克隆抗体与健康人外周单核细胞总蛋白、真菌感染病人外周单核细胞、真菌感染病人骨髓细胞总蛋白特异性结合，图5A-2和5A-3的3个条带的灰度比图5A-1的3个条带要深，说明dectin-1在真菌感染病人的外周单核细胞和骨髓细胞高表达。由于人dectin-1和小鼠dectin-1的编码序列有很高的同源性，提取野生型小鼠骨髓来源的巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage，BMDM)，用白念珠菌刺激小鼠BMDM，30 min后抽提BMDM总蛋白。以3株制备的单克隆抗体为一抗，蛋白质印迹法显示，制备的抗体可以识别BMDM中的dectin-1蛋白(图5B)。上述结果说明制备的3株抗体均可以特异性识别人和小鼠的dectin-1分子。

图5　Dectin-1单克隆抗体对内源性 dectin-1的识别能力检测 Figure 5　Western blot analysis and detection of natural dectin-1 by dectin-1 monoclonal antibody A：Dectin-1单克隆抗体检测人外周血单核细胞和骨髓细胞中dectin-1的表达；B：Dectin-1单克隆抗体检测小鼠BMDM中dectin-1的表达；1：健康人外周血单核细胞总蛋白； 2：真菌感染 病人外周血单核细胞总蛋白；3：真菌感染病人骨髓细胞总蛋白

3讨论

Dectin-1是介导机体抗真菌感染固有免疫应答的重要受体，在巨噬细胞和树突状细胞等固有免疫细胞上高度表达。研究表明，dectin-1可以识别白念珠菌酵母态，启动固有免疫应答效应，发挥抗白念珠菌感染作用[5-8]。

Dectin-1胞外段的CRD主要参与配体的识别，其在C型凝集素受体家族中高度的保守，dectin-1的胞外段除能识别β-葡聚糖外，还能识别T细胞表面的未知的内源性配体，促进T细胞增殖[4]。另有研究表明，dectin-1能够识别凋亡细胞，介导凋亡细胞的吞噬，表明在凋亡细胞的表面也有dectin-1能够识别的配体[10]。本实验克隆了包括CRD在内的人dectin-1的整个胞外区片段，构建了pET28a(+)-dectin-1(202 bp-744 bp)质粒。该表达质粒在E.coliBL21(DE3)中可高效表达重组蛋白。利用纯化的目的蛋白免疫小鼠来制备抗体，通过一系列的Elisa和抗原蛋白质印迹法验证，获得了5株单克隆细胞株。通过进一步的筛选，3株抗体可以识别小鼠的BMDM以及人的外周血单核细胞中的dectin-1分子。研究表明，在真菌感染过程中，dectin-1可以被诱导高表达[9]，用3株制备的抗体检测真菌感染病人的外周血单核细胞和骨髓细胞的总蛋白，发现3株抗体都能有效地检测到dectin-1表达的上升。提示制备抗体可以用于检测真菌感染病人

及其愈后。对于dectin-1等C型凝集素受体的深入研究将有助于对机体的免疫调节和稳态维持的深入认识，从而对真菌感染和自身免疫性疾病的治疗、疫苗的研制，以及新药的研发等起指导作用。而dectin-1特异性抗体的成功制备，对于深入研究dectin-1在抗真菌免疫中的作用有很大帮助。

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[修回日期]2015-03-15

[本文编辑]贡沁燕