双位点微透析-HPLC联用平台的构建与评价

·论著·

双位点微透析-HPLC联用平台的构建与评价

王丹1,刘春生2,吕进3,曹淼1,胡晋红4,石力夫4*

(1.第二炮兵总医院药学部，北京 100088；2.第二炮兵总医院骨科，北京 100088；3.第二炮兵总医院核与辐射损伤实验室，北京 100088；4.第二军医大学长海医院药学部，上海 200433)

[摘要]目的：建立微透析-HPLC联用技术平台，以便自动取样与自动进样同步完成。方法：应用10孔自动进样阀将微透析取样与HPLC进行连接，以葛根素透析液为模型药物对仪器性能进行方法学评价。在线和离线微透析-HPLC联用装置相关指标采用SPSS 13.0统计软件进行t检验。结果：在所建立的HPLC色谱条件下葛根素在0.1～100 mg/L线性关系良好(r=1,n=5)。低、中、高浓度葛根素对照品溶液日内精密度RSD分别为1.53%、0.60%、0.33%(n=5)，日间精密度RSD分别为0.92%、0.52%、0.67%(n=5)；重复性RSD=1.07%(n=5)。葛根素对照品溶液在36 h内稳定性良好(RSD=1.05%)；定量限为0.2 mg/L(S/N=10)。建立的微透析-HPLC在线与离线装置进行比较，结果显示在线装置的日内、日间精密度和稳定性均显著优于离线装置(P<0.05)。结论：自行研制的双位点微透析-HPLC联用技术平台设备简便实用，可为药动学与代谢研究提供新的取样分析检测方法。

[关键词]双位点微透析；色谱法，高效液相；在线联用；葛根素

[中图分类号]R917[文献标志码]A

DOI：10.5428/pcar20150211

基金项目国家自然科学基金(81301662),中国博士后科学基金(2013M532151)

作者简介王丹(女)，博士后，主管药师.

[收稿日期]2014-05-09

Construction and evaluation of the on-line platform of double-site microdialysis combined with HPLC method

WANG Dan1,LIU ChunSheng2,Lü Jin3,CAO Miao1,HU JinHong4,SHI LiFu4*(1.Department of Pharmacy，Second Artillery General Hospital of PLA,Beijing 100088,China；2.Department of Orthopedics,Second Artillery General Hospital of PLA，Beijing 100088,China；3.Laboratory of Nuclear and Radiation Injury,Second Artillery General Hospital of PLA，Beijing 100088,China；4.Department of Pharmacy,Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)

ABSTRACT[]Objective：To establish the microdialysis and HPLC(MD-HPLC) on-line platform,in order to achieve synchronization of automatic sampling and feeding.Methods：The 10-pore automatic sampling valve was used to connect microdialysis with HPLC instruments.Puerarin was used as the model drug to verify the MD-HPLC performance.Statistical software SPSS 13.0 was used to compare the related data of on-line instrument with those of the off-line by t-Test.Results：Under the established HPLC detection conditions，puerarin showed good linearity at a level of 0.1-100 mg/L，with a correlation coefficient (r) of 1 (n=5). For the low，median and high concentrations of puerarin，relative standard deviations (RSDs) of the inter-day precision were 1.53%，0.60% and 0.33% (n=5)，while RSDs of the intra-day precision were 0.92%，0.52% and 0.67% (n=5),respectively. RSD of repeatability was 1.07% (n=5). Within the period of 36 hours，puerarin standard solution was stable (RSD=1.05%) and quantification limit was 0.2 mg/L (S/N=10). Results showed that the precision，reproducibility and stability of the on-line instrument were all superior to those of the off-line，when comparisons were made between the two (P<0.05). Conclusion： The self-made double-site MD-HPLC on-line platform was simple and practical，and could provide a new approach for sampling and analysis in the research of pharmacokinetics and drug metabolism.

[KEY WORDS]double-site microdialysis；chromatography,high performance liquid；on-line combination；puerarin

[Pharm Care Res，2015，15(2)：123-125,154]

E-mail：wdyy_618@sina.com

*通信作者(Corresponding author)：石力夫，E-mail：shilifu72227@sohu.com

20世纪末到21世纪初，微透析取样技术实现了与色谱分析的在线联用，并出现多位点取样[1-3]。在线联用真正实现了生物体内待测组分的实时、动态分析，对不稳定、易降解检品尤为适用，也更能真实反映体内内源性或外源性生化物质及其代谢产物浓度的瞬间变化过程。

本研究采用适宜材料，自制加工所需接口与管路，扩展现有10孔自动切换阀和HPLC仪控制软件的功能,整合软件与硬件系统，使微透析取样与HPLC进样在设定好的时间内在线联用，成功建立自制微透析取样与HPLC分析在线联用技术平台(在线微透析-HPLC)，并用模型药物葛根素对平台进行了评价。

1仪器和试药

1.1仪器LC-10ADVP HPLC仪(包括SPD-10AVP可变波长紫外检测器，日本岛津公司)；10孔自动进样阀(美国VICI公司)；微透析设备(美国BAS公司)；Hypersil-C18色谱柱(大连依利特分析仪器有限公司)；聚丙烯管(PP管，苏州天裕塑胶有限公司)；聚醚醚酮管(PEEK管，美国 Upchurch Scientific公司)；弹性熔融石英毛细管(TSP石英管，美国 Polymicro Technologies公司)；瞬间生物兼容性黏合剂(美国 Cyberbond公司)；AG285型电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

1.2试药葛根素对照品(含量99%，批号110752-200511，中国食品药品检定研究院)；磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7．4)；甲醇(色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司)；水为三蒸水(第二炮兵总医院制剂室生产)；其他试剂均为分析纯。

2方法和结果

2.1葛根素测定色谱条件Hypersil-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)； 流动相：甲醇∶0.1%乙酸水溶液=30∶70；流速：1.0 ml/min；柱温：25 ℃；检测波长：221 nm；进样量：10 μl；灵敏度：0.01 AUFS。

2.2微透析-HPLC联用技术平台的连接

2.2.1微透析与10孔自动进样阀的连接本装置主要包括3个连接口、10孔自动进样阀的连接两大部分。3个接口的连接是将不同内外径尺寸的PP管、PEEK管、TSP石英管通过瞬间生物兼容性黏合剂固定而成(见图1)，其中接口1与接口2连接方法相同(见图2)。调整灌流液流速，缓慢注入到在线微透析-HPLC设备中。观察自制在线微透析-HPLC管路系统有无漏液、出现气泡等状况，实验装置通畅、密闭、死体积小，符合实验要求。

2.2.210孔自动进样阀与HPLC仪的连接10孔自动进样阀由①～⑩共10个连接孔组成，具体见图3。通过孔④实现微透析设备与10孔自动进样阀连接，HPLC流动相通过孔①流入，与定量环中的透析液一起流入HPLC色谱柱中，收集透析液的定量环漫溢后经孔⑥流出，孔②与⑦相连保证10孔自动进样阀的密闭性，通过孔⑨实现10孔自动进样阀与HPLC系统连接，孔③与⑩连接定量环1，孔⑤与⑧连接定量环2。

图1　微透析-HPLC在线联用连接管路示意图 Figure 1　Diagram of microdialysis-HPLC on-line platform

图210孔自动进样阀与微透析和
HPLC设备管路连接接口
Figure 2Pipeline interface of microdialysis and HPLC
through the 10-pore automatic sampling valve
接口1：a和b为聚丙烯管，c为探针进样管；接口3：a为聚丙烯管，
b为弹性熔融石英毛细管,c为聚醚醚酮管

图3　10孔自动进样阀连接示意图 Figure 3　Diagram of the 10-pore automatic sampling valve A：血液样品；B：皮肤样品

2.3微透析-HPLC技术平台的联用10孔自动进样阀的VCOM软件和HPLC工作站的CLASS-VP软件可同时在Windows XP系统中开启，VCOM软件可发送一系列既定时间间隔信号控制10孔自动进样阀的进样时间、间隔与循环次数，其中进样间隔取决于HPLC色谱工作站的出峰时间，循环次数取决于待监测药物的药动学过程。打开CLASS-VP软件，对HPLC色谱条件进行设定、保存，启动HPLC的同时开启VCOM软件界面，使其同步设定。10孔自动进样阀的A(皮肤探针微透析液样品)和B(血液探针微透析液样品)两个定量环如此循环往复，交替进样，样品的色谱峰被显示并保存在HPLC系统中。HPLC色谱工作站对保存的数据进行积分，可以获得葛根素在皮肤、血液中的待测药物峰面积(见图4)，从而计算药物浓度。

图4　血液和皮肤微透析液中葛根素的HPLC谱图 Figure 4　HPLC photograms of puerarin in blood and skin microdialysis fluids 1：血液样品中葛根素色谱峰；2：皮肤样品中葛根素 色谱峰；箭头所指为10孔自动进样阀切换时间

2.4微透析-HPLC在线联用技术仪器性能考察

2.4.1标准曲线工作液配制精密称取葛根素对照品100 mg，置100 ml容量瓶中，加PBS溶液,超声溶解并定容至刻度，摇匀,制成含1000 mg/L葛根素对照品储备液，并以此为母液，用PBS溶液分别配制0.1、1、2、5、10、20、50、100 mg/L的系列标准曲线工作液。

2.4.2线性关系考察取各浓度标准曲线工作液，分别设定10孔自动进样阀的程序自动进样，在2.1项色谱条件下分析测定，以浓度c(mg/L)为横坐标，峰面积积分值(A)为纵坐标，进行线性回归。在线回归方程为：A=31 304c+3 825.2 (r=1)，离线回归方程为：A=29 369c+7 846.8(r=0.999 9)，线性范围均为0.1～100 mg/L。

2.4.3精密度在2.1项色谱条件下，分别将高、中、低(100、10、0.1 mg/L)浓度的葛根素对照品溶液置微透析灌注泵中(流速2 μl/min)，设定10孔自动进样阀的程序(进样间隔6 min)，自动进样10 μl，每种浓度进样5次，考察日内精密度。 结果峰面积的RSD分别为1.53%、0.60%、0.33%(n=5)。实验条件同上，每种浓度进样5次，连续测定3 d，考察日间精密度，结果峰面积的RSD分别为0.92%、0.52%、0.67%(n=5)。

2.4.4重复性取浓度为1 mg/L的葛根素对照品溶液置微透析灌注泵中，同2.4.3项下方法每种浓度进样5次，在2.1项色谱条件下考察重复性。结果葛根素对照品溶液的RSD=1.07%(n=5)，表明重复性良好。

2.4.5稳定性取浓度为5 mg/L的葛根素对照品溶液分别置微透析灌注泵中(流速2 μl/min)，于0、2、4、6、8、10、12、24、36 h在2.1项色谱条件下，同2.4.3项下方法测定葛根素峰面积，其RSD=1.05%,表明在线微透析-HPLC测定葛根素对照品在36 h内稳定。

2.4.6定量限分别配制不同浓度的对照品溶液，自动进样10 μl,测得定量限为0.2 mg/L (S/N=10)。

2.5在线与离线微透析-HPLC的比较将所获得的自制微透析-HPLC在线联用平台仪器性能各参数指标，与离线联用指标进行对比(两者的HPLC条件相同)，结果见表1。应用SPSS 13.0软件对方法学各参数进行统计分析，回归系数采用方差分析，相关系数、精密度SD、重现性SD、稳定性SD采用t检验。结果表明，相关系数、回归系数本身及在线与离线的相关系数、回归系数的差值均具有统计学意义，比较精密度、重现性和稳定性，葛根素在线SD小于离线。因此得出结论，自行研制的在线微透析-HPLC联用平台，精密度、重现性、稳定性均优于离线，且差异有统计学意义(P<0.05)。

表1　微透析-HPLC在线和离线标准差(SD)比较

*P<0.05，与离线状态比较

3讨论

本研究所采用的10孔自动进样阀由一个10孔注射器和两个定量环组成。定量环的体积可以根据具体实验、所选择模型药物的不同而改变，并且根据实验的目的不同，选择与HPLC系统不同的连接方法。10孔自动进样阀将微透析取样透析液储存在定量环中，借助电动力将透析液注入到HPLC 色谱

柱中。它能够依次连续地装载样品，并按照预先设计好的时间间隔注入到HPLC分析系统中。为确保进样体积与定量环容积一致，蓄积体积>进样体积(切换时间×微透析灌注速度)。注入频率取决于HPLC完全分离样品并获得完整色谱峰图所需要的时间，在尽可能获得完整色谱峰的同时，也要最大限度提高微透析的时间分辨率，以全面反映药物在动物体内药动学信息。本研究中将切换时间设为6 min，微透析灌注速度为2 μl/min，蓄积体积为12 μl，进样体积为10 μl，2 μl自废液出口自动排出。

本研究建立的微透析-HPLC联用技术平台可自动取样、进样与分析，无需处理样品，减少样品的污染，无需使用样品收集瓶，减少转移过程损失，能够连续长时间对待测样品进行测定，能同时对2只以上实验动物进行考察，或对同一实验动物2个靶部位进行药物浓度测定，并且可以同时联接两台HPLC仪进行工作。本平台设备简便实用，也适用于其他分析监测仪器，节约人力、物力，降低研究成本，同时也为药动学与代谢研究提供全新的取样分析检测方法。

【参考文献】

[1]Zhang J,Jaquins-Gerstl A,Nesbitt K M,etal.Invivomonitoring of serotonin in the striatum of freely moving rats with one minute temporal resolution by online microdialysis-capillary high-performance liquid chromatography at elevated temperature and pressure[J].Anal Chem，2013，85(20):9889-9897.

[2]Chao Y Y,Wei Y T，Lee C T,etal.Membrane sampling with microdialysis coupled to HPLC/UV for on-line simultaneous determination of melamine and cyanuric acid in non-dairy coffee creamer[J].Anal Sci,2011,27(10):1025-1030.

[3]Xue C，Guo J，Qian D,etal. Identification of the potential active components ofAbelmoschusmanihotin rat blood and kidney tissue by microdialysis combined with ultra-performance liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2011,879(5-6):317-325.

[修回日期]2015-03-23

[本文编辑]阳凌燕