津力达颗粒对1型糖尿病大鼠生长激素-胰岛素样生长因子-1轴的作用

·论著·

津力达颗粒对1型糖尿病大鼠生长激素-胰岛素样生长因子-1轴的作用

卢晓晓，王超群，刘子毓，邹俊杰，刘志民*(第二军医大学长征医院内分泌科，上海 200003)

[摘要]目的：探讨津力达颗粒对1型糖尿病大鼠生长激素-胰岛素样生长因子-1(GH/IGF-1)轴的作用。 方法： 采用链脲佐菌素(STZ) 60 mg/kg腹腔注射制备1型糖尿病SD大鼠模型，随机分为7组：糖尿病模型组、低/中/高剂量津力达组、中剂量津力达+通心络组、二甲双胍组、沙格列汀组，另设正常对照组，每组5只。分别予以药物或安慰剂灌胃给药，8周后测定空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1C)、空腹胰岛素(FINS)、C肽、生长激素(GH)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)；实时(real-time)测定肝脏生长激素受体(GHR)mRNA。结果：与模型组相比，中、高剂量津力达组的FBG、HbA1C显著降低(P<0.05，P<0.01),FINS、C肽显著升高(P<0.05，P<0.01)；各药物治疗组血清GH显著降低(P<0.01)，IGF-1显著升高(P<0.01)。结论： 津力达颗粒可改善GH/IGF-1轴紊乱。

[关键词]1型糖尿病；津力达颗粒；生长激素；胰岛素样生长因子；大鼠

[中图分类号]R977.15,R965[文献标志码]A

DOI：10.5428/pcar20150206

基金项目国家重点基础研究发展计划(“973”计划，2005CB523304)

作者简介卢晓晓，硕士生. E-mail:1990-lxx@163.com

[收稿日期]2015-01-14

Effects of Jinlida granules on growth hormone/insulin-like growth factor-1 axis in type 1 diabetic rats

LU XiaoXiao，WANG ChaoQun，LIU ZiYu，ZOU JunJie，LIU ZhiMin*(Department of Endocrinology，Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China)

ABSTRACT[]Objective：To investigate the effect of Jinlida granules on the regulation of growth hormone/insulin-like growth factor-1 (GH/IGF-1) axis in type 1 diabetic rats. Methods： Type 1 diabetic SD rats were induced by intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ) 60 mg/kg. The diabetic rats were randomly divided into 7 groups:the diabetic model group，the low/median/high doses of Jinlida granules groups，the median Jinlida + Tongxinluo group，the metformin group and the saxagliptin group,each consisting of 5 rats. Another 5 normal rats were assigned as control. The rats were administered drugs or placebo by gavage，respectively. After 8 weeks，diabetic parameters were detected，including fasting blood glucose(FBG)，glycosylated hemoglobin Alc (HbA1C)，fasting insulin(FINS)，C peptide，growth hormone(GH),IGF-1，insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1). Hepatic growth hormone receptor(GHR) mRNA was detected by real-time PCR. Results：Compared with the levels of the diabetic model group,the levels of FBG and HbA1C were significantly decreased(P<0.05,P<0.01) in median and high dose Jinlida groups,and the levels of FINS and C peptide were significantly increased(P<0.05,P<0.01). Decreased serum GH levels were also detected in the median and high dose Jinlida groups,as compared with that of the diabetic model group(P<0.01)，and IGF-1 level was increased(P<0.01). Conclusion： Jinlida granules could improve the disorder of GH/IGF-1 axis in diabetic rats.

[KEY WORDS]type 1 diabetes mellitus；Jinlida granules；growth hormone；insulin-like growth factor;rats

[Pharm Care Res，2015，15(2)：103-106]

*通信作者(Corresponding author)：刘志民，E-mail：zmliu_cz@hotmail.com

糖尿病(diabetes mellitus)系胰岛素绝对或相对不足引起的、以慢性高血糖为特征的代谢性疾病。随着糖尿病的进展可引起多系统损伤，体内各激素水平均有不同程度的改变[1]。既往研究表明，糖尿病发生时，循环中生长激素(growth hormone，GH)水平升高，伴胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)水平降低，即GH/IGF-1轴紊乱[2]，而该轴的紊乱，又会导致胰岛素敏感性降低，血糖水平持续升高[3]。津力达颗粒以人参、桂枝、山药、黄精、苍术、佩兰、葛根等为主药，从中医角度改善水谷精微运化，从而发挥降糖作用[4]。本研究探讨不同剂量的津力达颗粒对1型糖尿病模型大鼠GH/IGF-1轴的作用。

1材料和方法

1.1实验动物雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，6～8周龄，体重180～220 g，共60只，购自第二军医大学实验动物中心(动物生产许可证号：SCXK(沪)2012-0003；使用许可证号：SYXK(沪)2012-0003)。大鼠饲养环境温度(20～25) ℃，湿度：40%～70%，12/12 h昼夜节律(人工光)，自由摄食、饮水，分笼饲养，5只/笼。

1.2药品和试剂津力达颗粒、通心络超微粉(石家庄以岭药业股份有限公司)；二甲双胍(中美上海施贵宝有限公司)；沙格列汀(阿斯利康制药有限公司)；链脲佐菌素(streptozotocin,STZ，低温、避光)、羟甲基纤维素钠(CMC-Na)、柠檬酸及柠檬酸钠(美国Sigma公司)；葡萄糖(Glu)测试盒、糖化血红蛋白(HbA1C)测试盒(南京建成生物工程研究所)；胰岛素、C肽放射免疫分析试剂盒(北京北方生物技术研究所)；GH、IGF-1、胰岛素样生长因子结合蛋白-1(insulin-like growth factor binding protein-1，IGFBP-1)酶联免疫分析试剂盒(武汉基因美生物科技有限公司)；SYBR Green PCR试剂盒、逆转录试剂盒(Thermo公司)；RNaseⅠ(Fermentas公司)；PCR引物(上海捷瑞公司)；Trizol(Invitrogen公司)；还原磷甘油醛脱氢酶(GAPDH，CST公司)；DEPC处理水(上海基尔顿生物科技有限公司)；氯仿、无水乙醇、异丙醇、10%水合氯醛(国药集团上海公司)。

1.3造模和分组SD大鼠适应性喂养3 d后，予以禁食、不禁水12 h，称重后随机抽取5只大鼠作为正常对照组(NC)，其余大鼠均腹腔注射STZ 60 mg/kg (用0.1 mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制成混悬液，pH 4.2～4.5，现配现用，30 min内用完)。3 d后尾静脉采血，检测FGB，选择FGB>16.7 mmol/L为标准，判断是否成模(去除死亡、不达标者，剩余35只大鼠)。采用随机数字表法将35只高血糖模型大鼠随机分为7组：糖尿病模型组(DM)、低剂量津力达组(JL)、中剂量津力达组(JM)、高剂量津力达组(JH)、中剂量津力达+通心络组(JM+T)、二甲双胍组(Met)、沙格列汀组(Sax)，每组5只。

1.4给药剂量和方法津力达低、中、高剂量分别为0.75、1.5、3.0 g/kg，中剂量津力达+通心络剂量为：1.5 g/kg津力达+0.4 g/kg通心络，二甲双胍为50 mg/kg，沙格列汀为1 mg/kg，均以0.5% CMC-Na胶体溶液配制，NC及DM组大鼠则给予等容量的0.5% CMC-Na。给药方法：每日灌胃1次(1 ml/100 g)，持续8周。

1.5取样和检测指标

1.5.1生化指标药物干预8周后，全部大鼠禁食、不禁水12 h后称重。腹腔注射10%水合氯醛 0.4 ml/100 g麻醉动物，腹主动脉采血，静置、离心、分离血清于-20 ℃保存，检测FBG、HbA1C、空腹胰岛素(FINS)、C肽、GH、IGF-1、IGFBP-1。

1.5.2肝脏生长激素受体mRNA的检测留取大鼠部分肝脏组织，置液氮罐中速冻，-80 ℃冻存。采用实时(real-time) PCR检测肝脏生长激素受体(growth hormone receptor，GHR)的mRNA，以GAPDH为内参。步骤：Trizol法提取样品总RNA→合成单链cDNA→实时定量PCR扩增→数据分析。引物：Primer F 5′ TGCTTTGCCTTTGCCTGAC 3′，Primer R 5′ ACATTCACTCTCACGCTCTCC 3′，183 bps。

2结果

2.1大鼠一般状况改变正常对照组大鼠一般状况良好，精神佳，反应灵敏，毛发光泽，体重增加，摄食、饮水及小便无明显改变。糖尿病模型组大鼠一般状况较差，精神不振，毛发杂乱无光泽，反应迟缓，活动量减少，出现“三多一少”症状。活杀时体重NC组(427.5±14.4) g，DM组(221.0±8.6) g，津力达各组 233～277 g；各药物干预组大鼠一般状况改善程度不同。

2.2FBG、HbA1C、FINS、C肽水平改变同正常对照组相比，模型组FBG、HbA1C水平升高，有统计学差异(P<0.01)；FINS、C肽水平降低，有统计学差异(P<0.01)。与模型组相比，中剂量津力达组、高剂量津力达组、中剂量津力达+通心络组、二甲双胍组、沙格列汀组FBG水平降低(P<0.05，P<0.01)；中剂量津力达组、高剂量津力达组、中剂量津力达+通心络组、二甲双胍组HbA1C水平降低(P<0.05，P<0.01)；低剂量津力达组、中剂量津力达组、高剂量津力达组、中剂量津力达+通心络组、二甲双胍组FINS水平升高(P<0.05，P<0.01)；各药物治疗组C肽水平均升高(P<0.05，P<0.01)。详见表1。

2.3GH、IGF-1、IGFBP-1水平改变与正常对照组相比，模型组GH、IGFBP-1水平升高，有统计学差异(P<0.01)，IGF-1水平下降，有统计学差异(P<0.01)。同模型组相比，各药物治疗组GH水平均降低(P<0.01)，IGF-1水平均升高(P<0.01)；低剂量津力达组、高剂量津力达组、中剂量津力达+通心络组IGFBP-1水平降低(P<0.05，P<0.01)。详见表1。

2.4肝脏GHR mRNA水平改变与正常对照组相比，模型组肝脏GHR mRNA水平降低(P<0.05)；与模型组相比，中剂量津力达+通心络组、二甲双胍组肝脏GHR mRNA水平升高(P<0.05，P<0.01)。见图1。

表1各组大鼠FBG、FINS、C肽、HbA1C、GH、IGF-1、IGFBP-1水平的变化

Table 1Changes in the levels of FBG，FINS，C peptide，HbA1C，GH，IGF-1，IGFBP-1 in various groups of rats

组别FBG(cB/mmol·L-1)FINS(zB/μIU·ml-1)C肽(ρB/ng·ml-1)HbA1C(%)GH(ρB/μg·L-1)IGF-1(ρB/μg·L-1)IGFBP-1(ρB/μg·L-1)NC5.87±0.5566.50±0.769.69±0.231.51±0.2911.44±0.9829.31±0.8078.94±4.02DM14.99±1.11**20.93±2.42**2.70±0.30**3.64±0.43**28.51±1.31**8.17±0.41**147.28±6.62**JL13.25±0.9230.08±3.02△5.49±1.47△△3.12±0.2125.49±0.72△△13.56±0.69△△132.10±8.73△JM12.10±0.33△38.77±1.41△△4.38±0.61△2.34±0.19△22.80±0.46△△14.01±0.38△△152.94±10.22JH11.17±0.64△△43.59±3.30△△7.09±0.47△△1.81±0.52△△19.36±0.49△△16.45±1.03△△117.43±4.90△△JM+T9.94±0.37△△56.07±4.11△△7.45±0.61△△1.33±0.16△△18.81±0.77△△23.44±0.90△△119.91±8.43△△Met8.87±0.23△△63.21±2.76△△4.47±1.21△△1.35±0.22△△14.89±1.04△△19.98±0.81△△138.67±4.17Sax12.39±0.63△32.49±5.178.86±0.31△△2.96±0.3022.31±0.77△△14.43±0.83△△145.26±5.31

**P<0.01，与正常对照组比较；△P<0.05，△△P<0.01，与糖尿病模型组比较；FBG：空腹血糖；FINS：空腹胰岛素；HbA1C：糖化血红蛋白；GH：生长激素；IGF-1：胰岛素样生长因子-1；IGFBP-1：胰岛素样生长因子结合蛋白-1；NC：正常对照组；DM：糖尿病模型组；JL、JM、JH：津力达低、中、高剂量组 (0.75、1.5、3.0 g/kg)；JM+T：津力达 (0.75 g/kg)+通心络(0.4 g/kg) 组；Met：二甲双胍组；Sax：沙格列汀组

图1　肝脏生长激素受体 mRNA水平的改变 Figure 1　Changes in the levels of liver growth hormone receptor mRNA NC:正常对照组;DM:糖尿病模型组;JL、JM、JH:津力达低、中、高剂量组(0.75、1.5、3.0 g/kg)；JM+T:津力达(0.75 g/kg)+通心络(0.4 g/kg)组;Met:二甲双胍组;Sax:沙格列汀组； *P<0.05,与 正常对照组比较； △P<0.05, △△P<0.01，与糖尿病模型组比较

3讨论

垂体前叶细胞分泌的GH具有促进组织生长、调节物质代谢等作用，可促进肝葡萄糖合成、拮抗胰岛素、抑制葡萄糖的利用，从而升高血糖[5]。正常情况下，GH的水平受多种机制调节：下丘脑通过生长激素释放激素(growth hormone-releasing hormone，GHRH)和生长抑素对GH进行双向调节，同时GH的下游信号产物IGF-1也可负反馈调节GH[1,6]。IGF-1是GH与细胞表面GHR结合后产生的，具有类胰岛素作用[7]，循环中IGF-1主要来自肝脏。GH/IGF-1轴可共同调节机体内分泌代谢系统，对维持糖代谢的稳定有重要作用[8,9]。GHR、生长激素结合蛋白(growth hormone binding protein，GHBP)、IGFBPs等也可调节GH及IGF-1的水平及生物活性。1型糖尿病和2型糖尿病均存在GH/IGF-1轴的紊乱，该轴的异常与血糖控制不佳、胰岛素抵抗、胰岛素用量增加相关。长期高血糖状态下，多种因素可升高GH水平[6,10]。研究表明，糖尿病病人对GHRH刺激存在过度反应，且胰岛素对肝细胞GHR的表达有促进作用，故患糖尿病时，循环内胰岛素水平降低或胰岛素抵抗，致肝GHR表达减少，而循环中高GH也降低肝脏GHR表达，导致肝脏GH抵抗，最终导致IGF-1合成减少[11]，削弱了对GH的负反馈作用，GH持续处于高水平状态。不仅如此，糖尿病时循环中IGFBP-1水平升高，过多的IGFBP-1则形成磷酸化IGFBP-1,磷酸化的 IGFBP-1具有IGF-1高亲和力，可致循环内游离IGF-1减少[12]。

糖尿病在祖国医学范畴中属“消渴症”，系“脾”(即胰腺)功能异常，水谷精微运化失调，致烦渴、小便频数、倍食而消瘦。中医“脾”具有运化水谷和津液的作用，可产生精微(精气)，体内的卫气来自水谷运化后的精微，可附行经脉，输布全身，外至皮毛，内至脏腑。“脾”功能健全，才可保证正常的水谷运化及输布。津力达颗粒包括人参、黄芪、黄精、玉竹、苍术、佩兰、茯苓、黄连、桂枝等多味中药，其中人参、玉竹等可益脾养阴，苍术、桂枝等可化湿温脾，通过“健脾运精”，恢复“脾”之生机，改善营养、水津的转化及输布，从而达到降低血糖，减少消渴症状之效[4]。已有研究表明，津力达颗粒对胰岛B细胞具有保护作用，可增加胰岛素的分泌，改善胰岛素抵抗[13]。

本研究通过检测FBG、FINS、C肽、HbA1C等指标，以反映大鼠血糖及胰岛素的功能变化。结果发现，模型组FBG、HbA1C升高，FINS、C肽降低，而中、高剂量津力达颗粒治疗后各指标较模型组均有改善，且高剂量组效果优于中剂量组，表明津力达颗粒可降低血糖，改善胰岛细胞功能。中剂量津力达+通心络组降糖作用及升高FINS、C肽作用明显优于单用中剂量津力达组，表明通心络也有相同作用，合用后作用相加。通过检测GH、IGF-1、IGFBP-1及肝GHR，以反映大鼠GH/IGF-1轴的变化。结果发现，模型组血清GH、IGFBP-1水平明显升高，IGF-1水平明显降低，同时伴肝脏GHR表达降低。表明1型糖尿病大鼠体内GH/IGF-1轴紊乱，GH持续高水平及低IGF-1水平与血糖控制不佳相关。低、中、高津力达颗粒治疗后均使GH水平降低、IGF-1水平增加，且药效随着剂量的增加而增强，表明津力达颗粒对GH/IGF-1轴紊乱有改善作用，可降低GH水平，改善GH抵抗，升高IGF-1从而有利于降低血糖，改善胰岛素抵抗。高剂量津力达组还可降低IGFBP-1水平，间接增加游离IGF-1含量，提示津力达颗粒可通过修复GH/IGF-1轴功能，从而降低血糖。中剂量津力达颗粒与通心络的复方治疗可降低GH、IGFBP-1水平，升高IGF-1含量，使肝GHR表达上调，且作用明显高于中剂量津力达组，表明通心络也有调节GH/IGF-1轴的作用，两者合用后作用相加，可进一步促进GH/IGF-1轴功能的恢复，但其机制有待研究。从总体疗效来看，高剂量津力达组、中剂量津力达+通心络复方治疗组与二甲双胍组相近，可以肯定津力达颗粒的降糖作用。此外，中药制剂的作用为多靶点，津力达与通心络的合用可提高疗效，减少不良反应，改善糖尿病症状及其并发症。

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[修回日期]2015-02-06

[本文编辑]吴铭权