基于植物生长调节剂萘乙酸和6-苄氨基嘌呤组合的红花组织培养体系的优化

·论著·

基于植物生长调节剂萘乙酸和6-苄氨基嘌呤组合的红花组织培养体系的优化

薛英茹，李东巧，高越，郭美丽*(第二军医大学药学院生药学教研室,上海 200433)

[摘要]目的：建立高效的红花(Carthmus tinctorius L.)离体组织培养体系，为红花的基因操作搭建平台。方法：以萌发6～8 d的红花无菌苗子叶为外植体，选用MS基础培养基，应用萘乙酸(1-naphthylacetic acid,NAA)+6-苄氨基嘌呤(6-benzyl amino purine,6-BA)+激动素(kinetin,KT)为组织培养的植物生长调节剂，优化红花的组织培养体系。结果：红花组织培养的最佳植物生长调节剂配方为：NAA 2.0 mg/L+6-BA 4.0 mg/L+KT 20.0 mg/L，添加活性炭(4 g/L)或硝酸银(5 mg/L)，光照时间为16 h/d，光照强度9000 lx，培养温度为(25±2) ℃，平均愈伤组织发生率高达86.4%，而且再生芽生长稳定，重现性高。结论：本研究优化建立了红花的不定芽再生体系，为红花基因操作平台的建立奠定了基础。

[关键词]红花；组织培养；萘乙酸；6-苄氨基嘌呤；激动素

[中图分类号]R931.2[文献标志码]A

DOI：10.5428/pcar20150203

基金项目国家自然科学基金(81173484,81473300)，上海市自然科学基金(13ZR1448200)

作者简介薛英茹(女)，硕士生.

[收稿日期]2014-12-09

Optimization ofCarthamustinctoriusL. tissue culture system based on the combination of 1-naphthylacetic acid and 6-benzyl amino purine

XUE YingRu，LI DongQiao，GAO Yue，GUO MeiLi*(Department of Pharmacognosy，School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China)

ABSTRACT[]Objective：To establish the regeneration system of safflower (Carthamus tinctorius L.),so as to create a platform of gene manipulation of safflower.Methods：Through tissue culture experiments，cotyledons germinated 6-8 days of safflower were selected as explants and cultured with Murashige and Skoog(MS) as the basal medium at (25±2) ℃ temperature with 16 h/d illumination and 9000 lx light intensity. Results：The optimum callus medium of safflower was MS basal medium supplemented with 1-naphthylacetic acid(NAA) 2.0 mg/L+6-benzyl amino purine(6-BA) 4.0 mg/L+kinetin (KT) 20.0 mg/L and addition of acticarbon(4 g/L) or silver nitrate(5 mg/L)，which made the callus mean rate as high as 86.4% and with higher regeneration bud grow stability and reproducibility. Conclusion：The research optimized adventitious shoot regeneration system and established the foundation for safflower gene manipulation platform.

[KEY WORDS]CarthamustinctoriusL.;tissue culture;1-naphthylacetic acid;6-benzyl amino purine;kinetin

[Pharm Care Res，2015，15(2)：91-94]

E-mail：xueyingru469376081@126.com;

李东巧(女)，硕士生.

E-mail：butterfly_qiao@163.com；两人为共同第一作者

*通信作者(Corresponding author)：郭美丽，E-mail：mlguo@126.com

红花(CarthamustinctoriusL.)是菊科一年或两年生草本植物，红花花冠是传统的活血化瘀中药，具有扩张冠状动脉、抗凝、降血压、耐缺氧、防治血栓、抗炎镇痛等多种药理作用，临床应用广泛[1,2]。建立高效的红花离体组织培养再生体系，对于红花的基因改造具有极其重要的意义。国内外有关红花的组织培养工作一直有断断续续的报道，但由于红花含有大量黄酮类成分，容易褐化，不同产地、不同红花品种再生所需要的诱导条件不同，以及红花自身的特性等，导致其再生芽生长非常困难[3,4]。因此，红花再生体系的建立，一直是红花组织培养的一个难题，也是红花基因操作没有取得突破性进展的重要原因。有文献报道，在培养基中添加高浓度的赛苯隆(thidiazuron)可以提高红花组织培养的生芽率[5-7]，但赛苯隆价格昂贵，不适用于后续实验的研究和大规模的工业化生产。有关常用的外源植物生长调节物质萘乙酸(1-naphthlacetic acid，NAA)、6-苄氨基嘌呤(6-benzyl amino purine,6-BA)进行红花的组织培养虽有报道[8-13]，但均为零星研究，重现性差，难以作为稳定的组织培养条件应用于红花的后续研究。因此，探索并优化红花的组织培养条件仍然是红花研究中需要解决的一个关键性问题。本研究旨在应用廉价的植物生长调节剂NAA、6-BA、激动素(kinetin,KT)，通过摸索不同植物生长调节剂浓度的配比，结合添加抑制组织褐化的活性炭或硝酸银等，建立重现性好而且稳定的红花离体组织培养体系，为红花的基因操作、遗传转化等搭建平台。

1材料和培养条件

1.1仪器智能光照培养箱(南京贝帝实验仪器有限公司)；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台 (苏州净化设备有限公司)；手轮型不锈钢立式灭菌锅(上海达平仪器有限公司)；pH计(上海阔思电子有限公司)；TES数位式照度计(泰仕电子工业股份有限公司)。

1.2试药乌鲁木齐红花品种种子(采自第二军医大学药学院药圃，经第二军医大学药学院生药学教研室郭美丽教授鉴定)，种子经消毒、萌发后获得无菌苗；氢氧化钠、乙醇(国药化学试剂有限公司)；MS粉(上海日出生物科技有限公司)；琼脂粉、6-BA、NAA、KT(美国Sigma公司)；双蒸水(第二军医大学药学院药剂学教研室自制)；氯化汞(HgCl2，第二军医大学教保处)；硝酸银、活性炭(北京索莱宝公司)。

1.3培养条件培养温度为(25±2) ℃，光照时间16 h/d，光照强度9000 lx，湿度60%。

2方法和结果

2.1无菌材料的获得种子经流水预处理后，加入75% 乙醇处理30 s后用无菌水冲洗2次，每次5 min，再用0.1% HgCl2处理种子25 min，用无菌水冲洗4～5次，每次5 min。用无菌滤纸吸干表面水分，接种到无植物生长调节剂的MS固体培养基上，一个培养基瓶中约10粒种子。选取7 d左右无菌的红花子叶为外植体，剪切成0.2～0.5 cm2的远轴面接种在诱导培养基上。各种诱导培养基均以MS为基本培养基，附加不同浓度的NAA、6-BA、KT，放入智能光照培养箱中培养，每5 d换一次新鲜培养基。

2.3诱导红花子叶不定芽的植物生长调节剂配比根据预实验结果，设计不同浓度植物生长调节剂配比，设计方案见表1。每个配方接种60个外植体，各配方重复3次。为了减少褐化，尝试在培养基中添加活性炭(4 g/L)和硝酸银(5 mg/L)，观察子叶再生芽的生长情况。在红花子叶外植体不定芽的诱导过程中，作者前期(约2周)以6～7 d为一继代单位进行继代，后期以3～4 d为一继代单位进行继代。

愈伤发生率=(出愈伤组织块数/有效外植体总数)×100%

出芽率=(长芽外植体数/有效外植体总数)×100%

2.4对红花子叶愈伤诱导的影响红花子叶外植体在添加不同浓度植物生长调节剂配比的培养基上培养，在配方2中愈伤最多，平均愈伤发生率达86.4%(表1)。红花子叶外植体在配方2上培养15 d后愈伤较致密，呈青绿色(见图1A)；培养23 d后愈伤致密，数量多，呈青绿色(见图1B)。

2.5对红花子叶出芽诱导的影响红花子叶外植体在添加不同浓度配比的植物生长调节剂的培养基上培养，在配方2、配方3和配方4中长出再生芽，且在配方2中平均出芽率达12.5%(见表1)。子叶在配方2上培养29 d后再生芽生长良好，颜色青翠，长0.5～0.7 cm(见图1C)；培养34 d后再生芽有3～4小簇，颜色青翠，长0.5～1.0 cm；在49 d后再生芽生长旺盛，长1.0～1.5 cm(见图1D)。子叶在配方3中平均出芽率为3.4%(见表1)，培养49 d后再生芽细小，长约0.5 cm，与培养基接触的部分有些褐化(见图2A)。子叶在配方4中平均出芽率为6.7%，培养49 d后芽纤细，长约1.0 cm(见图2B)。

表1　植物生长调节剂不同浓度配比对红花子叶愈伤诱导和出芽诱导的影响

*P<0.05，**P<0.01，与配方1比较；△△P<0.01，分别与配方1、3、4、5比较；NAA：萘乙酸；6-BA：6-苄氨基嘌呤；KT：激动素

图1　配方2培养15 d(A)、23 d(B)后愈伤生长情况及培养29 d(C)、49 d(D)后再生芽生长情况 Figure 1　Formula 2 callus formed from cotyledons explants after 15 d induction (A)，23 d induction (B),and adventitious buds presentation at adaxial cut ends of cotyledons explants after 29 d induction(C),49 d induction(D)

图2　配方3(A)和配方4(B)培养49 d后再生芽生长情况 Figure 2　Formula 3(A)and formula 4(B) adventitious buds began to present at adaxial cut ends of cotyledons explants after 49 d induction

2.6添加活性炭或硝酸银对子叶再生芽的影响子叶外植体在添加硝酸银的培养基上培养50 d后再生芽生长旺盛，颜色青翠，褐化减少，有丛生现象；55 d后，再生芽生长旺盛，颜色青翠，褐化减少，有多处丛生现象(见图3A)；在添加活性炭的培养基上55 d再生芽生长旺盛，褐化减少(见图3B)。未添加硝酸银和活性炭的培养基上55 d再生芽纤细(见图3C)。

3讨论

George等[12]于1982年提出，红花组织培养与品种本身基因型差异相关，且依赖于外界培养基的供给。Orlikowska等[13]在1993年首次在MS培养基中添加NAA(0.1 mg/L)和6-BA(0.5 mg/L)，可诱导出丛生芽，且转接到1/2 MS+NAA(1 mg/L)上生根，芽的生根率分别为31% 和67%，启示了可以应用外源植物生长调节剂供给内源植物生长调节剂使之达到平衡。随后的研究中，红花组织培养中添加高浓度的赛苯隆在一定范围内提高了红花组织培养的生芽率[6,7]，但赛苯隆价格昂贵，制约了后续实验研究。本实验室前期用已报道的高比率再生体系[6,10,13]进行重复时，皆没有获得再生芽，可能是由于红花品种之间差异所致。在组织培养过程中，由于器官分化对植物生长调节剂需求的不定性，主要由生长素和细胞分裂素的比例控制。不同生长素和细胞分裂素种类和浓度以及两者不同比例对愈伤组织和再生芽的诱导，与外植体供体植物种类、外植体本身的生理状态或生长调节物质敏感性密切相关，所以不同植物生长调节剂种类和不同比例之间的相互作用，会引起植物不同的生理效应。KT主要促进细胞分裂和愈伤组织分化，不诱导愈伤组织的产生，但可以使愈伤组织处于一种良好的状态，提高植株的再生频率[14]。

图3　添加硝酸银(A)、活性炭(B)及未添加这两者(C)55 d后再生芽生长情况 Figure 3　Adventitious bud growth at adaxial cut ends of cotyledons explants at day 55 after addition of sliver nitrate (A) and activated carbon (B)，and without addition of the two (C)

作者前期的预实验，在培养基中添加0.25、0.5、1.0 mg/L浓度的NAA和1.0、2.0、4.0 mg/L浓度的6-BA，并进行随机组合，发现6-BA的浓度对外植体愈伤的诱导及生长影响较大。在随机配方NAA 0.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+KT 20.0 mg/L中愈伤较多，且随着NAA与6-BA浓度配比的加大，愈伤呈现质地致密，颜色青绿色，能长出再生芽，再生芽颜色青翠，但生长缓慢。因此，在本实验中，进一步增加了NAA和6-BA的浓度范围。作者的研究表明，当NAA浓度在2.0 mg/L，6-BA浓度在4.0 mg/L时，外植体愈伤生长较快，数量多且质地紧密，再生芽生长旺盛，易于重复。

本研究结果表明，采用MS+2.0 mg/L NAA+4.0 mg/L 6-BA+20.0 mg/L KT的植物生长调节剂配比，光照时间为16 h/d，光照强度9000 lx，培养温度为(25±2) ℃，湿度60%的条件，使红花的平均愈伤发生率高达86.4%，且产生了稳定的丛生芽，同时添加活性炭(4 g/L)或硝酸银(5 mg/L)，减少了褐化现象，提高了丛生芽的生芽率。下一步，作者将重点进行红花不定根的诱导工作，为红花的基因操作搭建平台。

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[修回日期]2015-03-19

[本文编辑]刘海涛姚春芳