测定莫西沙星和利福布汀联合给药后大鼠的血药浓度及其药动学变化

·论著·

测定莫西沙星和利福布汀联合给药后大鼠的血药浓度及其药动学变化

俞鑫1，黄李飞1，石磊1，黄怡1*，肖和平2*

(1.第二军医大学长海医院呼吸内科，上海 200433；2.同济大学附属上海市肺科医院结核科，上海 200433)

[摘要]目的：建立测定大鼠血浆中莫西沙星和利福布汀浓度的HPLC法，并分别研究莫西沙星和利福布汀单独及联合灌胃给药后，大鼠血浆中两药的药动学。方法：血浆样品采用甲醇沉淀蛋白，莫西沙星采用HPLC-UV法测定，利福布汀采用HPLC-MS法测定。18只大鼠随机分为3组：莫西沙星(40 mg/kg)和利福布汀(30 mg/kg)单独给药组，以及莫西沙星(40 mg/kg)和利福布汀(30 mg/kg)联合给药组，比较联合给药后两种药品的药动学与单独给药时的差异。结果：莫西沙星和利福布汀浓度在0.05～5、0.15～30 μg/ml线性关系良好(r=0.999 9)；最低定量限分别为0.05和0.15 μg/ml；两药提取回收率及日内、日间RSD均符合方法学测定要求。与各自单独给药相比，联合给药时莫西沙星AUC0～t、AUC0～∞显著升高(P<0.05)，清除率显著降低(P<0.05)；利福布汀AUC0～t、AUC0～∞显著升高(P<0.05)，表观分布容积(Vd)、清除率显著降低(P<0.05)。结论：本研究建立的两药血药浓度测定方法简单、准确、可靠，适用于莫西沙星与利福布汀药动学研究。与单独给药时相比，莫西沙星和利福布汀联合给药后两药的清除率降低，生物利用度增加，在体内具有协同作用。

[关键词]莫西沙星；利福布汀；药代动力学；血药浓度；色谱法，高效液相；大鼠

[中图分类号]R969,R978.3[文献标志码]A

DOI：10.5428/pcar20150213

基金项目国家科技重大专项项目(2013ZX10003009-004)

作者简介俞鑫(男)，硕士生.

[收稿日期]2015-01-21

Concentration determination of moxifloxacin and rifabutin in rat plasma after co-administration and changes in pharmacokinetics

YU Xin1，HUANG LiFei1,SHI Lei1，HUANG Yi1*,XIAO HePing2*(1.Department of Respiratory Diseases,Changhai Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China；2.Department of Tuberculosis，Shanghai Pulmonary Hospital Affiliated to Tongji University，Shanghai 200433，China)

ABSTRACT[]Objective：To establish HPLC method to determine the concentrations of moxifloxacin and rifabutin in rat plasma，and also to study pharmacokinetics of moxifloxacin and rifabutin after single and combined oral medication to rats. Methods：The moxifloxacin and rifabutin plasma samples were prepared by adding methanol for protein precipitation，and the concentrations of moxifloxacin and rifabutin in the extracted solutions were determined by HPLC-UV and HPLC-MS methods,respectively. Eighteen SD rats were randomly divided into 3 groups：the moxifloxacin group (40 mg/kg)，the rifabutin group (30 mg/kg) and the combined medication group (with dosages of 40 mg/kg moxifloxacin and 30 mg/kg rifabutin)，each consisting of 6 animals. Then，differences in pharmacokinetic parameters of moxifloxacin and rifabutin were compared between the single and combined medication groups. Results：Moxifloxacin and rifabutin at concentrations of 0.05-5 μg/ml and 0.15-30 μg/ml，showed good linearity (r=0.999 9). The lowest detection limits were 0.05 and 0.15 μg/ml. The extraction recovery rates，inter-day and intra-day RSD of the 2 drugs all complied with the requirements of methodology. As compared with those of the single medication groups，the AUC0-t and AUC0-∞ of moxifloxacin and rifabutin in the combined medication group were significantly increased (P<0.05)，while clearance rates (CL) of the 2 drugs and apparent volume of distribution (Vd) of rifabutin were significantly decreased (P<0.05). Conclusion： The established method for the detection of the 2 drugs in plasma was simple，reliable and accurate，which could be applied to pharmacokinetic research of moxifloxacin and rifabutin. As compared with those of single medication，the clearance rates of the 2 drugs after combined medication were decreased. And it was shown that combined medication could increase bioavailability and seemed to have synergistic effect in vivo.

[KEY WORDS]moxifloxacin；rifabutin；pharmacokinetics；blood concentration；chromatography,high performance liquid;rat

[Pharm Care Res，2015，15(2)：129-133]

E-mail:657572731@qq.com

*通信作者(Corresponding author)：黄怡，E-mail:huangliur@163.com；肖和平，E-mail:xiaoheping_sars@163.com

结核病是我国较为常见的传染病，已成为严重的公共卫生问题和社会问题，在全球27个结核病高发国家中我国位居第二[1]。常规结核病治疗药物的长期使用、不合理应用以及不规律使用，导致耐多药结核(multi-drug resistant tuberculosis,MDR-TB)以及复治肺结核病人的大量产生，给结核病的治疗与控制带来了诸多困难。如何选择药物并且制定合理、高效、低毒的方案已成为治疗MDR-TB的关键。WHO推荐了一系列二线药物及一线药物替代品用于治疗MDR-TB，如新一代喹诺酮类莫西沙星、利福布汀(rifabutin)等。

目前，莫西沙星和利福布汀虽然在临床上广泛用于MDR-TB的治疗，且疗效得到普遍认可，但还未有关于两药联合用药快速血药浓度监测以及药动学相互影响的报道。本研究分别采用HPLC-UV和HPLC-MS法测定莫西沙星和利福布汀在大鼠血浆中的药物浓度，观察其在单独及联合给药后大鼠体内的药动学特点，以及两药的相互影响，为临床血药浓度监测提供方法学依据，并为药物相互作用研究提供参考。

1仪器和试药

1.1仪器安捷伦1100高效液相色谱仪和G1946D单四级杆串联质谱仪(包括ESI源、G1379A真空脱气机、G1311A四元泵、G1367A自动进样器、G1316A柱温箱和G1315B VWD检测器，美国安捷伦公司)；KUDOS-SK2200H超声发生器(上海科导超声仪器公司)；METTLER AE240型十万分之一电子天平(德国梅特勒公司)；DJ-04药材粉碎机(上海淀久公司)。DAS 3.0软件(上海博佳医药科技有限公司)。

1.2药品和试剂盐酸莫西沙星对照品(Code Y000703，ID 006YI7，纯度>98.0%)，利福布汀对照品(纯度>98.0%，批号 130586-200901)，加替沙星对照品(纯度>98.0%，批号 150612-200804)均为中国食品药品检定研究院提供；积雪草酸对照品(含量>98%，批号 12022401，中国科学院成都生物研究所)；盐酸莫西沙星片(规格 400 mg/片，批号 BJ13520，拜耳医药保健有限公司)；利福布汀片(规格 0.15 g/片，批号 063130508，四川明欣药业有限责任公司)。羧甲基纤维素钠(CMC-Na,批号 1103259，上海展云化工有限公司)；甲醇(色谱纯，美国Burdick & Jackson公司)；乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸(色谱纯，瑞士Fluka公司)；水为超纯水。

1.3实验动物SD大鼠18只，雄性，4～6周龄，体重220～250 g，购自上海斯莱克研究动物有限责任公司，动物生产许可证编号：SCXK(沪)2008-0016，合格证编号：2007000514232。

2方法和结果

2.1色谱条件(1)利福布汀：Agilent ZOBAX色谱柱 (150 mm×4.6 mm，5.0 μm)，流动相为乙腈∶水(含0.1%甲酸)=65∶35(V/V)；流速：0.4 ml/min，分析时间12 min，柱温：25 ℃，进样量:5 μl，内标为积雪草酸。(2)莫西沙星:色谱柱同上，流动相为乙腈∶水(含0.1%甲酸)=25∶75(V/V)；流速：0.8 ml/min，分析时间8 min，柱温：30 ℃，进样量：5 μl，内标为加替沙星。

2.2质谱条件和紫外检测条件(1)质谱条件:采用ESI源负离子模式，毛细管电压3500 V，干燥气流速10 L/min，雾化气压力241.33 kPa(35 psi,1 psi=6.895 kPa)，干燥气温度350 ℃。选择离子模式(SIM)利福布汀的离子[M-H]-m/z845.4和内标积雪草酸的离子[M-H]-m/z487.3，碎片电压100 eV。(2)紫外检测条件:在295 nm波长下进行检测。

2.3溶液的配制

2.3.1莫西沙星对照品溶液及其内标溶液的配制精密称取莫西沙星对照品10.0 mg至10 ml量瓶中，加甲醇定容，得浓度为1.0 mg/ml的莫西沙星对照品储备液，临用时用甲醇稀释成相应的浓度。称取内标加替沙星对照品10.0 mg，用甲醇溶解，制得浓度为1.0 mg/ml的加替沙星对照品储备液,用甲醇稀释后制得浓度为2 μg/ml的加替沙星内标溶液。

2.3.2利福布汀对照品溶液及其内标溶液的配制精密称取利福布汀对照品10.0 mg至10 ml量瓶中，加甲醇定容，得浓度为1.0 mg/ml的利福布汀对照品储备液，临用时用甲醇稀释成相应浓度。称取内标积雪草酸对照品10.0 mg，置100 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，得浓度为100 μg/ml的积雪草酸内标溶液。

2.3.3大鼠灌胃用溶液的配制取盐酸莫西沙星2片(800 mg)，用刀轻轻去除包衣，药材粉碎机充分研磨，精密称取400.0 mg，加入0.5%的CMC-Na无菌注射用水40 ml溶解，制得浓度为10.0 mg/ml的莫西沙星混悬液。取利福布汀2片(300 mg)，同法去除包衣并研磨，精密称取150.0 mg，加入0.5%的CMC-Na无菌注射用水20 ml溶解，制得浓度为7.5 mg/ml的利福布汀混悬液。分别取利福布汀4片(600 mg)，莫西沙星2片(800 mg)，同法去除包衣并研磨，分别精密称取莫西沙星和利福布汀400.0、300.0 mg，粉末混合均匀，加入0.5%的CMC-Na无菌注射用水40 ml溶解，制得利福布汀(7.5 mg/ml)与莫西沙星(10.0 mg/ml)混合溶液。

2.4给药方案及血浆样品采集18只健康SD大鼠用随机数字表法分为A、B、C 3组，每组6只，禁食12 h过夜。按照莫西沙星以及利福布汀药品说明书成人常用剂量分别为400、300 mg/d，经体表面积折算得到大鼠给药剂量分别为40、30 mg/d。A、B、C组分别灌胃给予莫西沙星40 mg/kg(4 ml/kg)、利福布汀30 mg/kg(4 ml/kg)、利福布汀和莫西沙星混悬液(莫西沙星40 mg/kg，利福布汀30 mg/kg)4 ml/kg。分别于给药后0、5、10、15、30、45、60 min，2、4、6、8、12、24 h眼眶取血0.5 ml，置于1.5 ml涂有肝素钠的EP管中，上下振摇3次，2×103×g离心5 min，取上清液，置-20 ℃冰箱中保存待用。

2.5血浆样品的前处理取联合给药组大鼠血浆样品100 μl，置1.5 ml塑料离心管中，加入200 μl浓度为2 μg/ml的加替沙星内标溶液，涡旋混合30 s后，8×103×g离心10 min。取150 μl上清液于进样瓶中，进样5 μl，用HPLC-UV法测定莫西沙星浓度。再取上清液20 μl，加入180 μl浓度为300 ng/ml的积雪草酸内标溶液，涡旋30 s，取150 μl上清液于进样瓶中，进样5 μl，用HPLC-MS法测定利福布汀浓度。

2.6方法学考察

2.6.1方法特异性研究在上述研究条件下，莫西沙星和利福布汀与血浆中内源性物质分离完全，内源性成分不干扰分离分析，两药保留时间分别为7.8和6.6 min，加替沙星和积雪草酸的保留时间分别约为6和7.5 min，色谱图见图1和图2。信噪比(S/N)>10时莫西沙星和利福布汀最低定量浓度分别为0.05和0.15 μg/ml；S/N>3时莫西沙星和利福布汀在血浆中的检测限分别为0.02和0.05 μg/ml。

图1　大鼠血浆中莫西沙星和内标加替沙星的HPLC谱图 Figure 1　HPLC photograms of moxifloxacin and the internal standard gatifloxacin in plasma of rat A：空白血浆；B：空白血浆+莫西沙星+内标加替沙星；C：给药后大鼠血浆样品；1：加替沙星；2：莫西沙星

图2　大鼠血浆中利福布汀和内标积雪草酸的HPLC-MS谱图 Figure 2　HPLC-MS photograms of rifabutin and the internal standard asiatic acid in plasma of rat A：空白血浆；B：空白血浆+利福布汀+内标积雪草酸；C：给药后大鼠血浆样品；1:利福布汀；2:积雪草酸

2.6.2标准曲线的制备取空白血浆 100 μl，精密加入莫西沙星、利福布汀混合对照品溶液20 μl涡旋混匀，配成含莫西沙星浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/ml，以及利福布汀浓度分别为0.15、0.3、0.6、1.5、6、15、30 μg/ml含药血浆，按2.5项下方法操作，进样分析，记录色谱图。以待测物浓度(X)为横坐标，待测物峰面积与内标峰面积的比值(Y)为纵坐标，求得莫西沙星回归方程:Y=8.185 2X-0.210 4 (r=0.999 9)。结果表明，莫西沙星在0.05～5 μg/ml浓度范围线性良好。利福布汀回归方程:Y=1.134 9X-0.042 6(r=0.999 9)。结果表明，利福布汀在0.15～30 μg/ml浓度范围线性良好。

2.6.3精密度和准确度实验制备莫西沙星和利福布汀浓度分别为0.05、0.5、5.0 μg/ml及0.15、1.5、15 μg/ml的低、中、高浓度对照品血浆(每个浓度5份)，按照2.5项下方法处理后，于1 d内5个不同时间点测定，连续3 d。将待测物峰面积与内标峰面积的比值代入当天的随行标准曲线求得实测浓度，计算日内、日间精密度与准确度。结果日内、日间RSD<5%(见表1)。准确度以方法回收率表示，同法制备低、中、高浓度对照品血浆样品各5份，按照2.5项下方法处理后，进样分析，记录色谱峰面积，计算待测物峰面积和内标峰面积的比值，代入标准曲线方程，计算实测浓度与加入浓度的比值即为方法回收率。结果见表1。

表1　精密度和回收率实验结果

2.6.4基质效应和提取回收率同法制备低、中、高浓度对照品血浆样品各5份，按2.5项下方法处理后，进样分析得峰面积作为Set3；取空白血浆，按2.5项下操作，取上清液后加入混合对照品溶液，使之浓度与Set3待测理论浓度一致，每个浓度平行操作5份，进样分析得峰面积作为Set2；将对照品溶液用甲醇稀释，使之与Set3待测理论浓度一致，进样分析得峰面积，重复进样5次，作为Set1。基质效应为Set2/Setl，提取回收率为Set3/Set2，结果待测化合物与内标的基质效应均>90%，说明基质效应影响较小，为可接受范围。 待测化合物与内标的提取回收率均>80%(具体见表1)，结果表明回收率良好。

2.7稳定性考察同法制备低、中、高浓度对照品血浆样品，考察室温(25 ℃)放置3 h、预处理后室温放置24 h、预处理后4 ℃放置24 h、冻融3次和-40 ℃冻存30 d的稳定性。结果待测物浓度无明显变化，RSD均<10% (n=3)， 表明莫西沙星和利福布汀在血浆中稳定。

2.8血样测定按2.4项下方法采集血样，测定18只SD大鼠灌胃给药后各个时间点的血药浓度，并绘制平均血药浓度-时间曲线，见图3。药动学参数采用DAS 3.0软件以非房室模型进行分析，达峰浓度(cmax)和达峰时间(tmax)取实测值，对药动学参数进行处理，得到药动学参数结果见表2。

图3　莫西沙星和利福布汀的 平均血药浓度-时间曲线 Figure 3　The mean drug concentration-time curves of moxifloxacin and rifabutin A：莫西沙星；B：利福布汀； ○：单药组； ●：联合用药组；n=6， ±s

采用SPSS13.1统计学软件比较药动学参数的组间差异。对所有参数进行正态性检验，结果均符合正态分布。采用两个独立样本的t检验进行分析。 由表2可见，莫西沙星与利福布汀联合给药与各自单独给药相比，莫西沙星AUC0～t、AUC0～∞显著升高(P=0.04)，CL显著降低(P=0.01)；利福布汀AUC0～t(P<0.01)、AUC0～∞(P=0.04)显著升高，Vd(P=0.01)、CL(P=0.02)显著降低。

表2莫西沙星和利福布汀的主要药动学参数

Table 2Main pharmacokinetic parameters of moxifloxacin and rifabutin

组别AUC0～t(A/mg·h·L-1)AUC0～∞(A/mg·h·L-1)t1/2(t/h)tmax(t/h)Vd(L/kg)CL(L·h-1·kg-1)cmax(ρB/μg·ml-1)莫西沙星单药组22.33±15.7922.52±15.923.43±2.430.67±0.479.00±6.361.78±1.264.94±3.49莫西沙星合用组35.02±9.78*35.13±9.76*2.90±0.501.25±0.404.89±2.081.15±0.34**6.03±1.27利福布汀单药组19.38±13.7026.32±18.6112.58±8.900.58±0.4120.31±14.361.15±0.812.08±1.47利福布汀合用组34.79±3.25**47.76±8.51*12.55±2.520.75±0.2511.34±0.45*0.64±0.13*2.95±0.02

*P<0.05，**P<0.01，与单药组比较

3讨论

本研究改进了血浆前处理方法，并未采用以往报道的固相萃取[2]和氮气吹干[3]，而采用甲醇直接沉淀法。通过改进血浆处理方法，减少了定量操作的步骤，使定量更准确，效率更高，提高了实用性。该方法可以高效、准确地测定血浆中莫西沙星和利福布汀的浓度，为进一步研究其在抗结核治疗多药联合中的药动学提供了方法学依据。

莫西沙星作为新一代喹诺酮类药物，对细胞内外的结核分枝杆菌均有较强杀灭作用，与其他常规抗结核药无交叉耐药性，已日益成为治疗耐药结核病的主要常规用药。利福布汀是利福平的螺旋哌啶衍生物，对结核杆菌和鸟分枝杆菌具有较强作用，尤其对生长繁殖期结核杆菌的抑制作用较为明显，与其他常规抗结核药无交叉耐药性。莫西沙星和利福布汀在临床上广泛用于MDR-TB以及复治结核病人，并且取得了良好的疗效。

付国萍等[4]研究发现，由利福布汀与莫西沙星组成的抗结核方案治疗MDR-TB时其痰菌转阴率以及病灶吸收情况，明显优于由利福喷丁与左氧氟沙星组成的方案，用于复治MDR-TB临床疗效肯定。此后，国内多个类似研究再次证明，以利福布汀、莫西沙星为主的治疗方案治疗MDR-TB，在痰菌转阴以及病灶吸收与空洞吸收方面具有明显优势[5，6]。虽然已有临床研究表明，莫西沙星与利福布汀两药联用治疗MDR-TB时，疗效优于其他不含此两药的方案，但是对于两药在体内的药动学相互影响还未明确。

本研究表明，与莫西沙星和利福布汀单独用药时相比，联用时两药部分药动学参数发生了显著变化。对于莫西沙星而言，与单独用药相比，联合用药时清除率显著下降，AUC0～t、AUC0～∞显著升高，说明利福布汀可能通过抑制莫西沙星代谢，从而增加莫西沙星的生物利用度。同样，联合用药时利福布汀在大鼠体内清除率下降，表观分布容积减小，同时峰浓度未发生显著变化，说明莫西沙星可能抑制了利福布汀在大鼠体内的代谢过程，从而增加了利福布汀在体内的生物利用度。莫西沙星和利福布汀作为浓度依赖性抗菌药，在体内的药物抗菌活性与AUC0～24 h/MIC有关，因此AUC的升高有利于在不增加剂量的同时提高体内药物的浓度，从而提高药物的疗效，进一步说明莫西沙星和利福布汀联用在药动学上具有协同作用，为临床两药联合的抗结核方案治疗提供了药动学理论依据。

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[修回日期]2015-03-06

[本文编辑]阳凌燕