壳寡糖对副溶血弧菌和溶藻弧菌抑制作用的研究

■ 袁香丽 宋 凯 王 玲 张春晓 李晓丽

(1.集美大学农业部东海海水健康养殖重点实验室，福建厦门361021；2.集美大学厦门市饲料检测与安全评价重点实验室，福建厦门361021)

壳寡糖(Oligochitosan，COS)是指2～10个氨基葡萄糖以β-1,4-糖苷键连接而成的低聚糖，也是自然界中大量存在的唯一的碱性氨基寡糖[1]，研究发现，壳寡糖具有调节免疫力、抗氧化、抑制肿瘤生长及抗炎反应、增强骨强度、抗菌、抗疟疾等作用[2-6]。研究认为，壳寡糖分子中的游离氨基带正电荷，可以与微生物表面的脂多糖和蛋白等阴离子物质发生静电相互作用，从而改变微生物细胞膜的通透性，阻止外界营养物质的进入和细胞内成分的释放，最终导致微生物死亡[7-8]。壳寡糖具有广谱抑菌活性，可以抑制多种植物病原菌、食品微生物以及人体和其它动物病原菌的生长。

副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）和溶藻弧菌（V.alginolyticus）是对虾养殖生产中两种重要的致病弧菌，发病率高，危害大。研究报道，溶藻弧菌会引起对虾黑鳃病和褐斑病，副溶血弧菌则引起对虾红腿病等[9]。对于弧菌病的防治，以往一直采用抗生素和消毒剂等化学药物治疗，然而使用化学药物会引起药物残留和抗药性的问题，不仅造成环境污染，而且给食品安全带来危害。壳寡糖作为一种新型的绿色饲料添加剂，其资源丰富，且无毒、无副作用，并且可以抑制有害菌，应用前景广阔，而有关壳寡糖对副溶血弧菌和溶藻弧菌抑制作用的研究尚不深入。

本试验选用副溶血弧菌和溶藻弧菌做为研究对象，采用平板计数法确定壳寡糖的作用浓度，研究壳寡糖对虾养殖中常见弧菌的抑制效果，旨在为壳寡糖在水产养殖中应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验菌

副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）和溶藻弧菌（V.alginolyticus），由集美大学水产学院病理实验室从感染这两种弧菌的凡纳滨对虾体内分离得到。

1.2 主要试剂

壳寡糖（所用壳寡糖分子量≤2 000 Da，脱乙酰度≥90%，聚合度2～8，来源于螃蟹壳，中泰和（北京）科技发展有限公司）、牛肉膏（上海源聚生物科技有限公司）、胰蛋白胨（北京陆桥技术有限公司）、琼脂粉（上海捷瑞生物工程有限公司）、酵母提取物（英国OXOID）、氯化钠（国药集团化学试剂有限公司）等。

1.3 壳寡糖溶液的配制

配制好的壳寡糖溶液，灭菌后备用。不同添加水平壳寡糖溶液的配制见表1。

表1 壳寡糖溶液的配制

1.4 试验方法

1.4.1 菌种活化

菌种活化所用的培养基为LB液体培养基，配好的培养基置于100 ml的锥形瓶中经121℃灭菌20 min后从灭菌锅里取出，放置在无菌操作台里，通风冷却至室温，接种副溶血弧菌和溶藻弧菌后于37℃、150 r/min条件下振荡培养24 h，进行第一次活化；第二次活化时将配好的LB液体培养基置于250 ml的锥形瓶进行活化，方法同第一次。菌体第二次活化完成后以10倍梯度稀释涂布法进行菌落计数。

1.4.2 壳寡糖对副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、溶藻弧菌（V.alginolyticus）的抑制试验

取菌液用生理盐水进行梯度稀释，副溶血弧菌稀释至10-6，溶藻弧菌稀释至10-5。试验时吸取1 ml的菌悬液与1 ml壳寡糖溶液置于5 ml离心管中混匀，放置培养箱37℃培养，分别在0、2、4、6 h进行平板涂布，24 h后进行菌落计数。

1.5 数据分析

所有数据均以“平均值±标准误（Mean±S.E.）”表示，采用SPSS 17.0分析软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），若存在显著的差异，则采用Duncan's法进行多重比较，P＜0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 壳寡糖对副溶血弧菌的抑制作用（见表2）

由表2可知，不同浓度壳寡糖组随着浓度升高，副溶血弧菌活菌数均有所减少，且随着壳寡糖浓度的升高及作用时间的延长其对副溶血弧菌的抑制作用增强。壳寡糖浓度为0%时，作用时间0 h除外，在任何时间点的活菌落数均显著高于其他添加壳寡糖水平组（P＜0.05），作用时间0 h，壳寡糖浓度为0.03%时，活菌落数显著高于0.12%壳寡糖组（P＜0.05），与其他组差异不显著（P＞0.05）；0.09%、0.12%的壳寡糖溶液作用时间在2、4、6 h时各组活菌数量显著低于其他组（P＜0.05），作用时间为6 h时，壳寡糖溶液浓度为0.09%和0.12%试验组的活菌落数均低于其他各组。

表2 不同浓度的壳寡糖对副溶血弧菌数量的影响

2.2 壳寡糖对溶藻弧菌的抑制作用（见表3）

由表3可知，壳寡糖溶液对溶藻弧菌作用0 h时，0%、0.03%、0.06%组之间溶藻弧菌活菌数无显著差异（P＞0.05），但与0.09%和0.12%组相比，活菌数量显著高于这两组（P＜0.05）；当壳寡糖溶液对溶藻弧菌作用时间分别为2 h和4 h时，0%和0.03%组之间溶藻弧菌活菌数无显著差异（P＞0.05），而0.09%和0.12%组溶藻弧菌活菌数显著低于其他组（P＜0.05）；当作用时间为6 h时，各组间均呈现显著差异（P＜0.05），且0.12%组壳寡糖组活菌数量最少。

表3 不同浓度的壳寡糖对溶藻弧菌数量的影响

3 讨论

本研究结果显示，随着时间的延长及壳寡糖浓度的增加，副溶血弧菌和溶藻弧菌活菌数量减少，意味着壳寡糖对两种弧菌具有一定的抑制作用。Liu等[10]研究发现，壳聚糖对大肠杆菌的抑制效果与作用时间具有显著相关性，添加壳聚糖2 h后大肠杆菌数量显著下降。王寿权等[11]研究发现，高浓度壳寡糖其抑菌时间也会延长。闫海侠等[12]研究发现，经壳寡糖处理后大肠杆菌活菌数量在0～4 h内明显减少。本研究结果表明，时间显著影响壳寡糖对两种弧菌抑制效果，随着作用时间的延长高浓度壳寡糖呈现出更好的抑菌效果。

有研究报道，壳寡糖的抑菌活性与其浓度密切相关。刘碧源等[13]研究发现，壳聚糖和壳寡糖均具有明显的抑菌作用，并且其抑菌活性随着浓度的升高而增强。王寿权等[11]自制壳寡糖的抑菌试验表明，自制壳寡糖具有较强的抑菌活性，而且随着浓度升高，抑菌活性不断增强。谢勇等[14]研究发现，不同浓度壳聚糖对幽门螺杆菌抑菌作用随着壳聚糖浓度的增加而增强，但当浓度大于4%时,其抑菌作用不再增强。有研究发现，100～1 000 μg/ml壳聚糖能够抑制R.solani和S.rolfsii孢子产生、萌发以及菌丝生长，且抑制作用具有浓度依赖性[15]。Li等[16]发现，浓度为2 000 μg/ml壳聚糖能够显著抑制细菌的生长，500 μg/ml壳聚糖乙酸盐溶液反而能促进细菌的生长，故而认为低浓度壳聚糖可被微生物分解利用，并促进其生长。因此，目前研究者普遍认为壳聚糖的抑菌性能是随着浓度的增大而增强的[10，17-18]。本试验中所使用壳寡糖的分子量≤2 000 Da，脱乙酰度≥90%，聚合度为2～8，结果显示，随着壳寡糖浓度的增加，其具有较好的抑菌活性，这与上述研究结果类似。

Pyo等[19]研究表明，杂壳聚糖及其寡糖对副溶血弧菌的抗菌效果与它们的分子量、脱乙酰度及所使用的菌株有关。Shin等[20]研究中处理非编织布料所用的壳寡糖分子量为1 814 Da，脱乙酰度为84%，当浓度为0.01%时对普通变形杆菌的抑菌率就达到90%，而对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌需0.05%，对肺炎克雷伯杆菌和铜绿假单胞菌即使浓度达到1.0%，抑菌率也只有30%。本试验结果表明，壳寡糖对副溶血弧菌和溶藻弧菌的抑制作用皆随其浓度增加和作用时间延长而显著增强，但当壳寡糖水平和作用时间不同时对两种菌的抑制效果存在差异，说明本试验条件下壳寡糖材料对副溶血弧菌和溶藻弧菌都有较好的抑制作用，且对不同病原菌的抑菌活性也存在一定差异。

4 结论

本试验中所用壳寡糖（分子量≤2 000 Da，脱乙酰度≥90%，聚合度为2～8）在体外对凡纳滨对虾致病菌——副溶血弧菌和溶藻弧菌皆有抑制作用，并且抑菌效果与壳寡糖浓度以及作用时间显著相关，建议应进一步研究壳寡糖在对虾养殖中的应用。