温度对两种不同蛋白源的对虾配合饲料中黄曲霉毒素产生的影响

■王小瑞 申 亮 郭 冉 夏 辉 解 伟 王美雪

（河北农业大学海洋学院，河北秦皇岛066003）

凡纳滨对虾作为当今我国水产养殖产量较高的品种之一，有着壳薄体肥肉鲜的优点，具有丰富的营养。作为养殖品种，具有广温广盐性和抗病能力强的特点。对虾养殖业的发展在促进沿海经济发展的同时，也促进了对虾饲料产业的快速发展。对虾养殖中配合饲料投喂的比例越来越大，高蛋白高脂肪的配合饲料极易产生霉菌毒素的污染。从配合饲料原料的角度出发，由于鱼粉和鱼油资源的短缺和价格的上涨，导致了植物蛋白和脂肪源的添加量不断增加。常用的替代原料包括大豆、玉米、谷物和油料作物等。这些原料在生长到变成原料的整个过程中都非常容易受到霉菌的污染；当外界环境适宜时，这些霉菌就可快速增长，并产生剧毒成分“霉菌毒素”。对虾产业受气候、行情影响较大，饲料生产和利用不同步，商品料配合原料和工艺不同以及储藏方法不当，霉菌污染，继而对水产养殖业造成影响。该行业的相关学者对霉菌毒素污染危害进行大量的研究表明，在水产养殖中影响较大的霉菌毒素主要有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、单端孢霉烯毒素(呕吐毒素和T2毒素)等。其中影响和危害最大的就是黄曲霉毒素(Aflatoxin，AFB1)，该物质的产生受到多种因素的影响，包括霉菌生长的基质、储存温度、相对湿度和pH值等。除原料影响外，储藏的湿度和温度也是饲料中产生黄曲霉毒素的主要因素。黄曲霉毒素进入动物机体后，会造成肝脏发生组织学病变，主要表现为：肝脏变得苍白、变脆以及胆管的上皮产生增生，肝脏变得肿大；另外，黄曲霉毒素还能对磷脂的合成以及胆固醇的合成产生抑制作用，影响脂类从肝脏的运输，从而使脂肪在肝脏中沉积，造成肝脏过多的脂肪累积浸润，产生肝脏肥大。另外，AFB1还能够在动物中造成免疫损伤，对于单核巨噬系统中的巨噬细胞，AFB1会造成其活性减弱，抑制其超敏性。若将微量的结晶的AFB1饲喂虹鳟、斑点叉尾鮰和鲤鱼时，均能引起这些鱼类的胆管增生，引发肝癌。给斑节对虾投喂含不同浓度AFB1的饲料时，其肝脏的上皮细胞会发生萎缩，还伴随有炎症反应，炎症反应与毒素作用时间和添加剂量相关。炎症发生初期，肝小管管腔之间的间质被血细胞浸润，炎症进一步发展会产生纤维变性及组织坏死。有报道指出，给虾类投喂含有AFB1的饲料，不仅会对饲料转化率和表观消化率产生影响，同时还会影响虾类的生长、引起生理失调，肝胰腺组织的病变，影响生产性能，从而导致经济损失。黄曲霉毒素不易被代谢排出体外，所以当摄入含有毒素的饲料后，AFB1可能在水产动物肌肉、脏器等器官或组织中累积，直接影响了对虾产品安全。同时，受霉菌毒素污染的动物抗病力下降，养殖户为保证其正常生产，增加抗生素用量，这也提高了抗生素在对虾产品中残留的风险。研究储存条件和饲料中易产生黄曲霉菌的原料对凡纳滨对虾饲料存储过程中AFB1产生量的影响，为对虾配合饲料的配方设计以及饲料储存方面都有指导意义。考虑到植物蛋白源可以显著节约饲料成本，因此将试验对象定为以鱼粉为主要蛋白源和以植物蛋白为主要蛋白源的两种饲料，在不同储存条件下储存两个月，研究饲料中黄曲霉毒素的产生量以及变化规律，为更好的储存配合饲料提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取两种蛋白源配比不同的凡纳滨对虾配合商业饲料，记为一号料和二号料，其中一号料以植物蛋白为主要蛋白源，二号料的主要蛋白源为鱼粉，二者的蛋白营养与其他营养物质均达到对虾生长的需求量，对凡纳滨对虾的生长效果没有显著影响。

1.2 试验设计

试验一采用2×7双因素试验设计，即储存条件（A因素）和储存时间（B因素），其中储存条件（A因素）为2个水平，即室温条件（参考试验地点当地气温与相对湿度，见表1）和模拟的实际储存条件（温度16℃，相对湿度50%条件下储存30 d后移到温度26℃，相对湿度50%的条件下储存）；储存时间（B因素）设7个水平，即0、10、20、30、40、50、60 d，每个处理三个重复。考察一号料中黄曲霉毒素B1的发生情况。

试验二采用与试验一相同的试验设计与处理，考察二号料中黄曲霉毒素B1的发生情况。

除分析单种饲料外，也将试验一与试验二结果进行交叉分析，将相同储存条件下的两种配合饲料AFB1的累积量进行比较，以此分析不同的蛋白配比对AFB1累积量的影响。

1.3 指标测定方法

检测AFB1的试剂盒购于上海佑隆生物科技公司，原理采用的是酶联免疫吸附法。

表1 试验期间试验地点的气温

1.4 数据处理及统计分析

本试验结果采用“平均数±标准差(Mean±SD)”表示，再进行单因子方差分析(One-way ANOVA)，若组间差异显著，再采用Duncan's多重比较法进行多重比较，差异显著性水平为P＜0.05，数据统计使用SPSS13.0分析软件。

2 结果

2.1 不同储存条件下一号料AFB1累积量随时间的变化趋势（见图1）

图1 不同储存条件下一号料AFB1累积量随时间变化趋势

在本试验期间范围内，所有试验饲料中黄曲霉毒素的含量均未超过国家限定的安全水平，饲料卫生国标中黄曲霉毒素 B1允许量：≤10 μg/kg（引自GB13078—2001），也未出现明显的霉变形态，所以为保障饲料安全，本试验提高安全标准，暂取黄曲霉毒素累积量到达8 μg/kg的时间作为对比不同饲料和不同环境对饲料中AFB1累积影响的评判标准。

由图1可知，对比一号料在不同的储存条件下AFB1累积情况，一号料在试验期间内AFB1的累积量不断升高，不同的贮藏环境对其前30 d影响不大，但是当试验温度从16℃升到26℃的仅10 d里，饲料中AFB1的累积量迅速增加，在第30～40 d饲料中黄曲霉毒素的含量超过8 μg/kg，而在室温下储藏的饲料在40～50 d这个范围内才出现快速累积，含量超过8 μg/kg。

2.2 不同储存条件下二号料AFB1累积量随时间的变化趋势（见图2）

图2 不同储存条件下二号料AFB1累积量随时间变化趋势

由图2得到，对比二号料在不同的储藏环境下AFB1累积情况，二号料并没有因为30～40 d的时候的温度变化而受到过多影响，所以环境影响比较小；虽然在试验期间黄曲霉毒素B1的积累量不断增加，不过增长速率缓慢，无论以哪种方式储存，在第60 d的时候，饲料中黄曲霉毒素B1的积累量都没有超过8 μg/kg。

2.3 室温储存条件下两种饲料AFB1累积量随时间的变化趋势（见图3）

图3 不同饲料AFB1累积量在室温环境下随时间变化趋势

由图3可知，两种饲料在同样的室温环境下储存，受到相同的环境因子的影响，其AFB1的累积量均呈上升趋势。试验开始前饲料中黄曲霉毒素的含量一号料要略低于二号料，在第20 d超过二号料。随着试验进行，黄曲霉毒素不断累积，前30 d一号料的毒素累积速率要大于二号料；第30～40 d，一号料的黄曲霉毒素含量降低，二号料增加超过一号料；但是第40 d后一号料受环境影响黄曲霉毒素的含量迅速增加，累积量超过8 μg/kg，在试验结束的第60 d其含量达到9.31 μg/kg，接近国家标准的限定水平。二号料在试验结束累积量则只达到7.77 μg/kg。

2.4 16℃和26℃储存条件下两种饲料AFB1累积量随时间的变化趋势（见图4）

由图4得到，两种饲料在16℃和26℃这种相同的变温环境下储藏，两种饲料的黄曲霉毒素的累积情况区别于室温环境下。一号料中黄曲霉毒素的累积速率快速增加，毒素含量在第30～40 d超过二号料，达到8.68 μg/kg，并持续增长；在试验结束的第60 d达到9.28 μg/kg。二号料受温度变化的影响远远小于一号料，虽持续增长但在试验结束的第60 d仅达到7.97 μg/kg，处于安全水平。

2.5 两种饲料在不同储存条件下AFB1增长速率（见图5）

图5 不同饲料在不同储存环境下AFB1增长速率

由图5可知，从两种饲料中AFB1累积的速率分析，一号料的毒素产生速率总体要快于二号料，而且一号料的毒素的产生速率受环境因素变化影响显著，其中温度对其影响最为明显；二号料的毒素产生速率虽然没有受到环境的显著影响，但是50～60 d后AFB1的产生速率都显著提高。

2.6 两种不同品质饲料在不同环境下综合对比（见图6）

图6 两种不同饲料在不同环境下综合对比

由图6可以看出，无论哪种储存条件，长达60 d的储存时间均会使AFB1的累积量显著增加。而室温储存下二号料的毒素累积量虽显著增加但总体增加的速率较小，而在16℃和26℃的条件下，二号料即便是储存时间长达60 d也未显示出显著性差异。

2.7 储存时间≥40 d后两种饲料AFB1累积量在不同储存条件下综合对比（见图7）

图7 储存时间≥40 d后两种不同品质饲料在不同储存条件下综合对比

在试验期中，两种饲料中的黄曲霉毒素的累积量在前30 d几乎没有出现显著差异。但由图7可知，在第40 d的时候，处于16℃和26℃储存条件下一号料的AFB1累积量显著高于其他三组；第50 d的时候一号料两种储存条件下的AFB1累积量都显著高于二号料；而对于二号料来说，虽然随着储存时间的推移，AFB1的累积量增加，但是在通用的储藏条件及时间里，可以保证处于安全水平。

3 讨论

3.1 储存条件对对虾配合饲料中AFB1累积量的影响

针对一号料，试验结果显示随着时间的累积，两种储存条件下其AFB1的累积量均呈现上升的趋势，且储存时间越久，AFB1的累积量差异性越显著。但增加最快的时间点不同，在16℃和26℃这种条件下，则是在30～40 d的阶段达到最快的累积速率，原因可能是因为第30 d后饲料转移到26℃的环境下储存，而26℃则是达到了黄曲霉菌的最佳产毒温度，从而使得AFB1的累积量迅速增加；而在室温条件下，饲料中的AFB1累积量在第40 d迅速增加，其毒素的累积速率在第50 d达到最大，结合试验地点温度分析，温度也是达到26℃，造成毒素的快速累积。加之降雨天数的增加，湿度变大，为霉菌的生长创造了条件。同时，储存40 d后一号料累积的黄曲霉毒素已达到8 μg/kg，接近饲料安全标准，属于重度霉变。

针对二号料，试验结果同样显示两种储存条件下AFB1的累积量呈现上升趋势，但增长速率相对缓慢，且温度变化较大时也不会对AFB1累积量有较明显的影响。且储存长达60 d时，二号料中AFB1的累积量在7.77～7.97 μg/kg，并未达到试验设定的毒素上限值(8 μg/kg)，只是产生轻度霉变。

结合两种料在不同储存条件下的AFB1累积量和累计速率分析，储存时间越长，饲料的毒素含量越高，累积量和累积速率受温度的影响很大。有研究证实，对虾产业受气候、行情影响较大，饲料生产和利用不同步，储藏方法不当，会对饲料中霉菌含量造成影响，继而影响霉菌的产生毒素的量。结合试验期气候变化，室温情况下是受高温多雨气候影响，AFB1的累积速率最快的时段的气候情况与黄曲霉毒素多发地区的气候相似。如我国南方特别是长江中下游地区，每年受梅雨影响严重，气温高、湿度大，有利于霉菌生长和产毒，因此污染程度要比北方地区更严重一些。当储存时间长达40～50 d，毒素累积量和累积速率均显著增加，不仅使饲料营养品质下降，同时还有可能在对虾体内造成累积，对对虾存活和生长产生影响。Bintvihok等在进行了仅10 d后的试验后发现，低于20 μg/kg的AFB1饲料就足以对对虾的肝胰腺的机能造成损伤，改变血淋巴正常的生化指标。因此，做好对虾配合饲料的储存在实际生产中有重要的意义。

3.2 饲料成分对对虾配合饲料中AFB1累积量的影响

在这两种储存条件下的试验结果显示，一号料中AFB1的累积速率均显著高于二号料，储存时间越长，差异越明显。在累积速率大的同时，其累积量在第40 d后已经超过试验设定的安全值8 μg/kg，已经达到重度霉变的程度。而二号料在储存时间长达60 d时，其毒素累积量仍未达到8 μg/kg，只表现出轻度霉变。同时，在饲料储存时间大于40 d的基础上分析AFB1的累积量可以看出，无论何种储存条件，一号料的毒素含量均显著高于二号料，说明饲料原料尤其是蛋白源对饲料中黄曲霉毒素的累积量影响显著。有报道指出，饲料的成分是影响毒素产生的重要因素，一些植物蛋白（如花生粕和棉籽粕等），饲料原料更适合黄曲霉毒素产毒真菌的生长和毒素的形成。同时，有研究表明，色氨酸能够阻止黄曲霉毒素的产生，而酪氨酸对其有促进作用。这可能也是造成一号料AFB1累积量高于二号料的原因，可能的原因是植物蛋白中色氨酸、赖氨酸等必需氨基酸的含量较低，而鱼粉所含的必需氨基酸齐全，且蛋白含量高。以鱼粉为主要蛋白源的二号料随着储存时间推移也会产生AFB1累积量的增加的现象，这可能与饲料中鱼粉的过氧化值有关系。有研究指出，鱼粉在储存期间的过氧化值会随时间增加，同时受温度影响较大。氧化酸败的饲料极易造成黄曲霉毒素的累积。但二号料中毒素累积量不断增加，但幅度缓慢，且并没有因为30～40 d的时候的温度变化而受到影响，同时其增长速率较一号料低，这可能在一定程度上与黄曲霉菌所感染的底物有关。另外，二号料在储存50～60 d后，其毒素速率明显增加，可能是因为饲料中的鱼粉是高油脂物质，其水解性酸败产生的游离脂肪酸会加剧脂肪的酸败，进而加速了鱼粉的氧化酸败，影响到黄曲霉毒素的产生，并且随着饲料储存的时间的延长，饲料中油脂的抗氧化性能下降，一旦油脂开始氧化，由于其是一个自身催化加速的过程，其速度便会成倍的增加。所以推测饲料在储藏60 d后如不使用，也存在AFB1超标可能。

4 结论

凡纳滨对虾配合饲料在从生产到销售再到使用整个阶段的储存中，饲料中黄曲霉毒素B1的累积量随时间的推移而增加，且时间越久其毒素累积速率越大。温度变化较大的储存条件对饲料的储存存在一定的不利影响。当凡纳滨对虾配合饲料中含有较高的植物蛋白源原料时，储存过程中应当注意储存的温度与条件，温度以不超过26℃为宜。尽管以鱼粉作为蛋白源有一定的储存优势，但储存时间尽量保持在50 d之内。

（参考文献24篇，刊略，需者可函索）