庄河大骨鸡抗粘液病毒基因和溶菌酶基因多态性的研究

张雪莹，任慧慧，田玉民，朱弘焱，苏玉虹

（辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁 锦州 121001）

庄河大骨鸡抗粘液病毒基因和溶菌酶基因多态性的研究

张雪莹，任慧慧，田玉民，朱弘焱★，苏玉虹★

（辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁 锦州 121001）

为研究庄河大骨鸡抗粘液病毒基因（myxovirus resistant，Mx）和溶菌酶基因（lysozyme，LYZ）的多态性，本试验从大骨鸡血液中提取DNA，PCR扩增Mx和LYZ基因后分别进行RsaI和Hind III酶切及琼脂糖凝胶电泳。研究结果表明，所选取的262只庄河大骨鸡Mx基因片段均能得到PCR扩增产物，产物大小为101 bp，经酶切后获得GG、GA和AA 3种基因型，基因型频率分别为0.744、0.229、0.027，因此大骨鸡Mx基因具有多态性；所选取的120只大骨鸡LYZ基因片段也均能得到PCR扩增产物，产物大小为590 bp，经酶切后仅获得一种基因型GG型，因此该基因此酶切位点上无多态性。本研究为庄河大骨鸡资源保存、品种选育和开发利用提供了科学依据。

庄河大骨鸡；抗粘液病毒基因；溶菌酶基因；内切酶RsaⅠ；内切酶HindⅢ

“庄河大骨鸡”又名“庄河鸡”，是我国著名的肉蛋兼用型地方良种，主产于大连庄河市境内，具有耐粗饲、体大、蛋大、毛色艳丽、肉味鲜美、营养价值高的特点，是辽宁省畜牧业“四大名旦”之一[1-3]。与引进肉食鸡和蛋鸡相比，庄河大骨鸡整体抗病力强，因此对大骨鸡抗病相关遗传特点的研究及开发利用具有重要的意义。

抗粘液病毒基因（myxovirus resistant，Mx）是家禽抗病力的重要候选基因之一，其蛋白是抗病毒蛋白的一种，由I型干扰素诱导后，在宿主细胞中产生，含有GTP酶活性[4]；抗病毒谱较广，可以抑制多种负链RNA病毒，还能抵抗某些DNA病毒。现有研究证明[4]，禽Mx蛋白具有抗A型流感病毒、水泡性口膜炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）等病毒的生物活性。Mx基因的存在方式是显性等位基因，研究发现[5]，通过克隆多个品系的鸡Mx基因并将序列比对，发现有25个核苷酸突变，其中15个导致了氨基酸的改变，预示鸡的Mx基因具有多态性。另有研究发现[6-7]，在众多氨基酸改变中，当cDNA的2032位点为A，即鸡Mx蛋白的第631位氨基酸为天冬酰胺（Asn）时，该蛋白对流感病毒和VSV有抗性，而当此位点为G，即Mx蛋白的第631位氨基酸为丝氨酸（Ser）时则无抗性。

1,4-0-溶菌酶（lysozyme，LYZ）又称N-乙酰基胞壁酸水解酶，最早由Baldacci等[8]于1979年从鸡的两个基因库中用分子克隆的方法纯化获得，全长约3.9 kb。其属于碱性水解酶，是体内重要的非特异性体液免疫因子，在内部渗透压的作用下引起细菌裂解[9-10]，有些溶菌酶还可发挥消化酶的作用，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性菌和真菌具有直接或间接的溶解作用，能够起到杀菌、抗病毒、抗肿瘤细胞等多种作用，在免疫系统中起着重要作用。

本研究旨在通过对庄河大骨鸡Mx和LYZ基因的多态性进行研究，筛选出对两基因抗性的个体，为大骨鸡候选基因标记辅助选择奠定基础，同时为大骨鸡抗病优良品种选育提供分子遗传学的依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物选用辽宁医学院畜牧兽医学院科研团队养殖的庄河大骨鸡，随机挑选262只健康雌鸡单笼饲养于同一鸡舍，管理条件完全相同，日粮参照美国NRC营养标准。

1.2 试验仪器与试剂蛋白酶K、琼脂糖、DL2000 Marker、DL1000 Marker、DL5000 Marker、20 bp DNA Ladder、限制性内切酶RsaI、限制性内切酶HindⅢ、PCR用Mix、上下游引物等均购自大连宝生物工程有限公司；其他均为分析纯试剂。试验仪器均为国产或进口设备，如超净工作台、高速冷冻离心机、恒温水浴箱、PCR扩增仪、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像系统、超纯水系统、-70℃超低温冰箱等。

1.3 试验方法

1.3.1 大骨鸡血液基因组DNA提取及质量检测 取大骨鸡静脉血2 mL，用裂解液、蛋白酶K和SDS进行细胞裂解，用酚、氯仿和异戊醇提取基因组DNA。将提取的大骨鸡基因组DNA在1%琼脂糖凝胶中进行电泳，检测DNA质量。

1.3.2 Mx、LYZ PCR扩增的引物设计 根据NCBI上基因序列号（LYZ基因：NC_006127.3；Mx基因：AF289468.1），使用Primer premier 5.0软件分别设计引物。Mx基因引物序列，F：CCTTCAGCCTGTTTTTTCTTCTTTTAGG，R：CAGAGGAATCTGATTGCTCAGGCGTGTA，产物大小为101 bp，LYZ基因引物序列，F： GCCACATAAAGTTTGAGC， R：GTACTCCCATCGGTGTTA，产物大小为590 bp。

1.3.3 大骨鸡Mx、LYZ基因片段PCR扩增 PCR扩增的反应组分如下：模板DNA 1 μL，引物（20 pmol/μL）各1 μL，mix混合液7.5 μL，加超纯水至15 μL。PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，Mx基因55℃退火45 s、LYZ基因49.3℃退火45 s，72℃延伸45 s；30个循环，最后72℃延伸10 min。用1%的琼脂糖凝胶进行PCR产物电泳，紫外灯下观察并照相。

1.3.4 PCR扩增产物的酶切及电泳检测 根据Mx、LYZ基因序列，利用Primer 5.0分析可知上述扩增片段内含有内切酶RsaI和内切酶HindⅢ酶切位点。限制性内切酶RsaI和HindⅢ的酶切反应体系按内切酶说明书要求，PCR产物10 μL，内切酶（10 U/μL）0.5 μL，10×Buffer 2 μL，加超纯水至20 μL，37℃恒温3～4 h，产物用2%琼脂糖凝胶电泳分析。

2 结果与分析

2.1 大骨鸡血液基因组DDNNAA质量检测大骨鸡血液DNA琼脂糖凝胶电泳结果见图1。图1可见大分子量的DNA条带，为基因组DNA。

2.2 大骨鸡MMxx、LLYYZZ基因 PPCCRR扩增结果采用所设计的引物，PCR扩增大骨鸡Mx、LYZ基因的部分片段，其琼脂糖凝胶电泳结果见图2和图3。由图2可见，Mx基因PCR产物大小约为101 bp，由图3可见，LYZ基因PCR产物大小约590 bp，均符合预期的扩增长度，可以用来进行RFLP分析。

图1 大骨鸡血液基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of genome DNA for blood samples of Zhuanghe Dagu chicken

图2 大骨鸡Mx基因PCR产物凝胶电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR ofMxin Zhuanghe Dagu chicken

图3 大骨鸡LYZ基因PCR扩增结果Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR ofLYZin Dagu chicken

2.3 PPCCRR产物酶切结果试验所设计的Mx基因PCR上下游引物间的具有一个RsaI酶切位点，大骨鸡Mx基因PCR产物酶切后电泳结果见图4，条带大小为101、74和27 bp，酶切后出现了3种带型，说明本试验检测的262只大骨鸡Mx基因具有多态性；试验所设计的LYZ基因PCR上下游引物间的具有一个HindⅢ酶切位点，大骨鸡LYZ基因PCR产物酶切后电泳结果见图5，条带大小为414 bp和176 bp，酶切后仅出现一种带型，说明试验检测的120只大骨鸡LYZ基因不具有多态性。

图4 大骨鸡Mx基因PCR产物酶切后凝胶电泳图Fig.4 Agarose gel electrophoresis of enzyme digestion for PCR products ofMxin Dagu chicken

图5 大骨鸡LYZ基因PCR产物酶切后凝胶电泳图Fig.5 Agarose gel electrophoresis of enzyme digestion for PCR products ofLYZin Dagu chicken

3 讨论

本试验用PCR-RFLP法扩增大骨鸡的Mx、LYZ基因，Mx基因片段长为101 bp，经RsaI酶切后电泳，检测到该位点有两种等位基因A、G，三种基因型GG、GA和AA，基因型频率分别为0.744、0.259、0.027。结果显示，大骨鸡Mx基因具有多态性，并且抗性等位基因A的频率为0.141。据文献报道，吴晓伟等[11]检测的中国地方鸡种中的肉蛋兼用型的Mx基因抗性等位基因A的频率为0.297，其检测的庄河大骨鸡的抗性等位基因A的频率为0.100，检测的红色原鸡的抗性等位基因A的频率为0.984；李慧芳等[12]检测的在12个中国地方鸡种中Mx基因抗性等位基因A的频率的平均值为0.304；栾德琴等[13]检测的Mx基因在11个不同鸡种中抗性等位基因A的频率的平均值为0.502，这与本试验结果存在一定差异，但本试验中大骨鸡该抗性等位基因的频率高于吴晓伟等[11]的检测结果。

LYZ基因片段长为590 bp，经限制性内切酶HindⅢ对扩增片段进行完全酶切后仅产生GG基因型（176 bp和414 bp），LYZ基因不具有多态性。据文献报道，侯启瑞等[10，14]发现LYZ基因有4处突变位点，第111、1 411、1 426和1 492位点（其中111位点位于第一外显子，1411位点位于第1内含子，1 426位点和1 492位点位于第2外显子）。经研究发现第1 411位点，等位基因G和A的频率分别为0.561和0.439，该位点对京海黄鸡不同周龄体重有显著影响，AA、GA基因型个体4周龄体重显著高于GG基因型个体4周龄体重，暗示在选种、育种过程中亦可将鸡LYZ基因作为京海黄鸡体重和开产日龄候选基因应用于遗传标记辅助选择。因此本试验选取该位点检测，但未检出多态性与文献报道存在一定差异，可能与品种以及不同品种之间的各自生存环境有关，也可能是多态性基因型频率低，受检样本量不足以检测出多态性。为更加确切地探明该基因在大骨鸡上是否存在多态性位点，需进一步通过测序鉴定。

本研究利用分子遗传标记技术筛选出与大骨鸡抗病性能相关联的分子标记-Mx和LYZ基因，对其遗传特点进行了研究，填补了庄河大骨鸡Mx和LYZ基因多态性的研究空白，后续将通过试验研究来进一步揭示大骨鸡抗病性基因的多态性与相关性状间的关系，来丰富家禽分子育种理论，加快育种步伐，为大骨鸡良种选育提供理论依据。

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Study on polymorphism of myxovirus resistant gene and lysozyme gene in Zhuanghe Dagu Chicken

Zhang Xueying,Ren Huihui,Tian Yumin,Zhu Hongyan*,Su Yuhong*
(College of Animal Husbandry&Veterinary Medicine,Liaoning Medical University,Liaoning Jinzhou 121001)

To analyze the polymorphism of myxovirus resistant(Mx)and lysozyme(LYZ)gene for Zhuanghe Dagu chicken,The technology of PCR-RFLP was used.The PCR products were digested with enzyme RsaI and HindⅢ.HindⅢ locus polymorphism of LYZ in Zhuanghe Dagu chicken was not detected,RsaI locus polymorphism of Mx was divided into three kinds of genotypes of GG,GA and AA, and the frequencies of genotypes were 0.744、0.229 and 0.027.The research provided the scientific basis for the resource preservation,variety breeding and the development and utilization of Zhuanghe Dagu chicken.

Zhuanghe Dagu chicken;Myxovirus resistant gene;Lysozyme gene;Enzyme RsaⅠ;Enzyme HindⅢ

S831

1672-9692(2015)11-0001-05

2015-09-11

张雪莹（1993-），女，本科。

朱弘焱（1984-），女，硕士，讲师，研究方向为动物分子遗传育种。

苏玉虹（1965-），女，博士，教授，研究方向为畜禽的遗传和育种。

辽宁省大学生创新课题（201410160010）、辽宁省科技厅计划项目（2014209006）、辽宁省自然科学基金项目（2015020765）及辽宁医学院领军人物资助项目