鸡睾丸间质细胞的分离及其鉴定的研究

杨淑华，于立辉，张 燚，龙 淼，李 林，高 锋，姜丽莹，韩 阳，王 雪，何剑斌

（沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁 沈阳 110866）

鸡睾丸间质细胞的分离及其鉴定的研究

杨淑华，于立辉，张 燚，龙 淼，李 林，高 锋，姜丽莹，韩 阳，王 雪，何剑斌★

（沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁 沈阳 110866）

为了寻找一种快速、高效的体外分离、纯化鸡睾丸间质细胞的方法，本试验采用Ⅱ型胶原酶消化以及PercoII分离液梯度离心，建立鸡睾丸间质细胞分离、纯化方法。结果表明，PercoII分离液梯度离心后，纯化的间质细胞3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-HSD）染色阳性率可达92.5%±1.7%，且在37℃、5%CO2条件下培养的细胞生长良好。该提取方法效果良好，可作为研究禽类生殖调控的细胞模型。

鸡；睾丸间质细胞；3β-HSD染色；梯度离心法

睾丸间质细胞（interstitial cell）又称Leydig cell，1850年由Leydig首先发现并加以描述，20世纪60年代确定它是合成分泌雄激素的内分泌细胞，分布在睾丸生精小管间的疏松结缔组织内，其含量占睾丸细胞数量的2%～4%[1]。其主要功能是分泌睾酮，分泌活动受丘脑下部、垂体及自身的调节，动物体内约95%的睾酮由间质细胞分泌[2]，睾酮被运输到身体各处的靶器官，通过与受体结合发挥重要的生理功能[3-4]。目前，国内外对大鼠、小鼠睾丸间质细胞分离培养的研究较多[5-8]，其他哺乳动物间质细胞分离培养的研究也有报道[9-10]，但禽类睾丸间质细胞的分离及鉴定培养尚无研究。本试验在参阅相关文献基础上，以Ⅱ型胶原酶消化睾丸组织，利用3β-HSD染色法对睾丸间质细胞进行鉴定，采用PercoII密度梯度离心法纯化分离的鸡睾丸间质细胞，获得高纯度的鸡睾丸间质细胞，为完善禽类睾丸间质细胞体外培养技术提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂去氢表雄酮（DHEA）、吖啶橙、0.25%Trypsin-EDTA、二甲基亚砜（DMS0）、MTT、DMEM/F-12细胞培养液、Percoll细胞分离液，胶原酶Ⅱ型系购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；无支原体胎牛血清购于浙江天杭生物科技有限公司；庆大霉素购于哈药集团制药总厂；异丙醇购于国药集团化学试剂有限公司；台盼兰购于Sigma公司。

1.2 试验动物2.5月龄的雄性海兰鸡，由沈阳农业大学实验场提供。

1.3主要试剂的配制 3β-HSD染液的配制：称取DHEA 0.0072 g，NAD0.159，NBT0.059，尼克酰胺0.08 g；DHEA溶于2.5 mL丙酮中，可加热助溶；然后将所有物质溶于40 mL的D-Hank’s液中，搅拌使其允分溶解，用0.22 μm的微孔过滤器过滤除菌，分装后4℃保存备用，长期保存在-20℃。

1.4 Leeyyddiigg细胞的分离与纯化①取2月龄左右雄性鸡，颈椎脱臼法处死，浸入75%乙醇中5 min，放入无菌的托盘，转移到超净台内，双侧腹股沟管内侧斜切U型切口，用眼科剪和镊子小心提起睾丸，去除其周围的脂肪组织，从附睾尾部剪断精索，获取完整的睾丸。②将睾丸浸入有少量冰冷的D-Hank’s缓冲液的培养皿中，冲洗3遍。置于另一无菌培养皿中，小心地剥去睾丸被膜，并尽量剔去睾丸组织内的细小血管，保持睾丸形态的完整和曲细精管的连续性，用D-Hank’s液冲洗睾丸实质1遍。③将分离干净的睾丸实质放入无菌的小青瓶内，按体积比1:5的比例加入胶原酶Ⅱ（1 mg/mL），密封瓶口。37℃，振荡消化约l0 min，至睾丸组织形状刚好消失，曲细精管间组织松散但连续而无明显断裂时，加入适量无血清的DMEM/F12培养液终止消化。④消化液经200目不锈钢筛过滤，滤液于4℃，1 000 r/min离心8 min，去上清。细胞沉淀用无血清DMEM/F12培养液稀释，将细胞悬液加于Percoll梯度液上（由下到上依次为70%、60%、30% Percoll各3 mL），低温离心30 mi（n4℃，3 000 r/min）。离心后，在管内可看到1条明显的目的细胞带，取出后，加入适量无血清DMEM/F12培养基充分混匀细胞，4℃，1 000 r/min离心8 min，去上清，反复操作一次以尽可能洗去残存的Percoll分离液。获得较纯化的间质细胞，加入适量含血清的DMEM/F12培养液制成细胞悬液。

1.5 Leeyyddiigg细胞的培养将细胞浓度调至5.0×105个/mL，接种后在37℃、5%C02、95%02和饱和湿度条件下培养。

1.6 Leeyyddiigg细胞活力的鉴定取上述分离纯化的睾丸间质细胞，调整细胞浓度为5.0×105个/mL，吸取10滴Leydig细胞悬液和l滴0.4%台盼蓝溶液混匀，静置3 min。健康细胞排斥台盼蓝而不被染色，丧失细胞膜完整性的死细胞可被台盼蓝染成蓝色，计算细胞活率。计算公式如下：

1.7 33β--HHSSDD染色鉴定Leeyyddiigg细胞由于睾丸组织内仅睾丸间质细胞内含有3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-HSD），故睾丸间质细胞可被特异性的染成蓝色。取要鉴定的细胞悬液，调整细胞浓度为5.0× 105个/mL，按2:1比例加入已配制的3β-HSD染液，放入C02培养箱继续孵育5 h，在显微镜下选取多个视野观察计数所有细胞及染成蓝色的细胞，计算Leydig细胞百分率。

2 结果与分析

2.1 Leeyyddiigg细胞存活率的测定结果纯化、分离后的睾丸间质细胞悬液经0.4%台盼蓝溶液染色后在光镜下观察，共计数200个细胞，其中死细胞被染成淡蓝色，活细胞拒染，重复记录4次，计算结果显示，间质细胞存活率为95.0%±1.3%。

2.2 33β--HHSSDD染色结果采用Percoll分离液梯度离心法分离、纯化鸡睾丸间质细胞，经3β-HSD染色鉴定睾丸间质细胞呈蓝色，纯化前睾丸间质细胞纯度为46.6%±2.3%（n=5），纯化后睾丸间质细胞纯度为92.5%±1.7%（n=5）。睾丸细胞经Percoll分离液纯化前后3β-HSD染色结果见图1和图2。

3 讨论

3.1 鸡睾丸间质细胞的分离与纯化睾丸既是产生精子的器官，又是分泌雄性激素的内分泌器官。目前，对睾丸生殖细胞的分离培养以组织块培养法和胰蛋白酶消化法为主。织块培养法操作简便，但对杂细胞的污染不容易控制；胰蛋白酶消化法利用酶对组织间质的作用使细胞团分散成单个细胞，使用此法能获得大量的活细胞，较快地建立细胞系，但胰酶会作用于细胞膜，长时间的胰酶环境会使细胞受到损伤。Ⅱ型胶原酶能渗透到睾丸组织内部，使胶原酶充分消化间质，本试验采用Ⅱ型胶原酶消化效果较好。Percoll是一种经聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒，无毒、惰性，且与生物膜不发生黏附，利用它分离的细胞能保持完整的生物学活性。以往研究表明，利用Percoll梯度离心法分离大鼠、小鼠睾丸间质细胞可获得较高的纯度[1,12-13]。本试验采用30%、60%及70%的Percoll梯度分离液分离睾丸间质细胞，经离心后，纯化的睾丸间质细胞主要集中在30%与60%Percoll浓度之间，此浓度范围内获得的睾丸间质细胞的纯度较高，形态典型，且体外细胞的特征与前人报道的一致[5]。本试验分离纯化的睾丸间质细胞存活率为95.0%±1.3%，说明分离、纯化操作过程规范，对睾丸间质细胞的损伤较小。

图1 纯化前间质细胞3β-HSD染色（200×）Fig.1 Before purification of interstitial cells stained with 3β-HSD(200 x)

图2 纯化后间质细胞3β-HSD染色（200×）Fig.2 Purified Leydig cells stained with 3β-HSD(200 x)

3.2 鸡睾丸间质细胞的 33β--HHSSDD染色鉴定3β-HSD是甾体类激素合成的关键酶之一，在睾丸间质细胞中表达，仅见于睾丸间质细胞光面内质网内，是公认的睾丸间质细胞的鉴定指标，是睾丸间质细胞的重要标志酶[5-7]。在3β-HSD染色液的作用下，细胞质被染成蓝色的即为睾丸间质细胞。本试验基于这一特征对分离、纯化的鸡睾丸细胞进行染色鉴定，结果表明，所分离纯化的细胞92.5%±1.7%是睾丸间质细胞。本试验成功建立了鸡睾丸间质细胞分离、纯化方法，为研究禽类的生殖试验提供体外细胞模型。

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The Isolation and Examination of Rooster Testis Leydig Cell

Yang Shuhua,Yu Lihui,Zhang Yi,Long Miao,Li Lin,Gao Feng, Jiang Liying,Han Yang,Wang Xue,He Jianbin*
(Department of Animal Husbandry and Veterinary Medicine Shenyang Agricultural University,Liaoning Shenyang 110866)

To find a high-efficient way to digest and purify rooster leydig cells.Methods:A multistep procedure including vascuIar perfusion,dissociation of type II collagenase and PercoII gradient centrifugation was employed.ResuIts:The purfied Leydig cell fraction after PercoII density-gradient centrifugation contained 92.5%±1.7%well-preserved 3β-hydroxysteroid dehydrogenase（3β-HSD）,The better cultural condition was 37℃,5%C02.ConcIusion:It suggests that the method is reIiabIe and has somewhat applicant prospect.

Cock;Leydig cell;3β-HSD;Gradient centrifugation

Q813

1672-9692(2015)11-0006-03

2015-09-29

杨淑华(1973-)，女，讲师，博士，从事畜禽营养代谢病与中毒病研究。

何剑斌(1969-)，男，教授，博士，从事动物产科疾病的诊断与治疗。

沈阳农业大学校青年基金(20121007)