丹参酮ⅡA对大鼠血管平滑肌细胞BIP和CHOP表达的影响
陈芳王 丽1沈晓君1王保奇1
(河南省人民医院,河南郑州450003)
摘要〔〕目的研究丹参酮ⅡA对同型半胱氨酸(HCY)诱导增殖血管平滑肌细胞(VSMC)内质网应激(ERS)相关基因免疫球蛋白重链结合蛋白(BIP)和C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(CHOP)表达的影响,探讨丹参酮ⅡA促进HCY诱导增殖VSMC凋亡的相关机制。方法大鼠VSMC原代培养、鉴定,建立HCY诱导的细胞增殖模型,用不同浓度的丹参酮ⅡA干预,Annexin/PI双染法检测细胞凋亡率;实时荧光定量PCR检测BIP和CHOP表达量。结果丹参酮ⅡA可促进VSMC凋亡,与HCY组比较差异显著(P<0.05,P<0.01);实时荧光定量PCR检测结果显示,与对照组比较,HCY刺激使BIP和CHOP表达上调(P<0.05,P<0.01);丹参酮ⅡA组剂量依赖性上调VSMC BIP表达,与HCY组比较差异显著(P<0.05,P<0.01);与HCY组比较,0.5 mg/L丹参酮ⅡA处理对大鼠VSMC CHOP表达无明显影响,而1 mg/L丹参酮ⅡA使CHOP表达上调(P<0.05,P<0.01)。结论丹参酮ⅡA可促进HCY诱导增殖的VSMC凋亡,凋亡过程由核转录因子CHOP介导,BIP基因可能是其作用靶点之一。
关键词〔〕丹参酮ⅡA;同型半胱氨酸;血管平滑肌细胞;BIP;CHOP
中图分类号〔〕R285.5〔文献标识码〕A〔
基金项目:河南省基础与前沿技术研究计划项目(112300410051);郑州市科技创新团队资助项目(121PCXTD520)
通讯作者:沈晓君(1955-),女,教授,主要从事心血管疾病中医药防治研究。
1河南中医学院
第一作者:陈芳(1986-),女,博士,主治医师,主要从事心血管病研究。
动脉粥样硬化(AS)及其所导致的心脑血管疾病是当今人类死亡的首位原因,血管平滑肌细胞(VSMC)增殖是AS的主要形态特征,也是AS时内膜肌层和内皮损伤的重要标志,许多危险因素可以通过促进VSMC增殖等效应引起AS病变形成〔1〕。本实验通过观察丹参酮ⅡA对同型半胱氨酸(HCY)诱导增殖的大鼠VSMC内质网应激(ERS)相关基因免疫球蛋白重链结合蛋白(BIP)和C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(CHOP)表达的影响,探讨丹参酮ⅡA促进HCY诱导增殖VSMC凋亡的机制和可能的作用靶点。
1材料与方法
1.1 材料丹参酮ⅡA对照品购自中国药品生物制品鉴定所,20 mg/瓶,批号:200619。HCY,Sigma公司产品,25 g/瓶,纯度≥98%,批号:C-7352。瑞舒伐他汀(可定),阿斯利康制药有限公司,国A2002002。二氧化碳(CO2)恒温培养箱(德国Heraeus公司);FACS Calibur 流式细胞仪(BD,USA公司产品);FLUOVIEW FV100共聚焦荧光显微镜(日本OLYMPUS公司);DMEM、胰蛋白酶(Gibco BRL. USA产品);Ⅱ型胶原酶 (Invitrogen,Carlsbad,CA,USA);逆转录试剂盒、实时定量试剂盒、总RNA提取试剂(均为日本Takara公司产品);α-SMA抗体(武汉博士德公司产品);PCR扩增仪(德国Whatman Biometra公司);实时定量PCR仪(美国Applied Biosystem公司)。
1.2 方法
1.2.1 大鼠VSMC原代培养雄性Wistar大鼠购自湖北省动物实验中心,体质量200~250 g,戊巴比妥钠腹腔麻醉,迅速分离取出腹主动脉,小心剥除血管外膜,纵行剪开血管,PBS液洗2次,剪成0.5~2 mm大小的组织块,放入含有1 mg/ml Ⅱ型胶原酶溶液的离心管中,37℃温箱中消化30 min,剧烈震荡离心管除去内皮细胞后将组织块取出,放入新鲜的1 mg/ml Ⅱ型胶原酶溶液中,继续37℃温箱中消化4~6 h,待组织块呈絮状后终止消化。离心,去上清,重悬细胞,转入培养瓶中。待细胞长至75%汇合度时,消化传代,取2~5代的血管平滑肌细胞用于实验。
1.2.2 免疫组织化学检测细胞接种到6孔板中培养72 h后,去上清,PBS液洗3次,4%多聚甲醛固定15 min,加入0.3%TritonX-100,倒掉后再加入TritonX-100室温透化15 min,滴加30 μl血清封闭液(二抗宿主来源)室温封闭30 min。加入一抗α-SMA抗体(1∶50),4℃孵育过夜。加入FITC标记羊抗小鼠二抗(1∶100),37℃孵育30 min,同时加4′,6二脒基-2-苯吲哚盐酸(4′,6-diamino-2-phenylindole,DAPI)染细胞核,37℃孵育30 min,封片后荧光显微镜下观察。
1.2.3 细胞分组与药物干预取生长状态良好的细胞胰酶消化后制备细胞悬液,调整细胞浓度为1×106/ml个。将处理好的盖玻片放入6孔板各孔中,每孔准确接种900 μl细胞悬液,继续培养后将细胞分为空白组、HCY组、瑞舒伐他汀(可定)组和丹参酮ⅡA组。除空白组外,各组均加入剂量为10-4mol/L同型半胱氨酸,培养24 h后,可定组加入终浓度10 μmol/L的可定,丹参酮ⅡA组分别加入终浓度0.5 mg/L、1 mg/L的丹参酮ⅡA,培养48 h后,收集细胞。
1.2.4 Annexin V-PI法检测细胞凋亡率各组PBS液洗涤,0.125%胰蛋白酶消化,转移至离心管中,加入培养液,混匀后1 000 r/min离心,弃上清,加PBS重悬细胞,调整细胞浓度为106/ml,取0.5 ml细胞悬液,1 000 r/min离心4 min,弃上清,加0.5 ml 上样缓冲液重悬细胞,加入1 μl荧光标记的Annexin V试剂,混匀后避光室温下孵育20 min,加入5 μl PI,混匀后避光4℃下孵育5 min,加入500 μl上样缓冲液,随即用流式细胞仪检测凋亡率,使用Flow max 2.4软件。
1.2.5 实时荧光定量PCR检测BIP和CHOP mRNA表达引物设计:BIP序列引物,正义:5′-GTTCTGCTTGATGTGTGTCC-3′,反义:5′-TTTGGTCATTGGTGATGGTG-3′;CHOP序列引物,正义:5′-CGCCTTCAACGACGAGTTCCTG-3′,反义:5′-GCTGTTCTTATCCACCGACTTC-3′;β-actin引物设计,正义引物:5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′,反义:5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′。提取每组细胞总RNA,逆转录合成cDNA。 PCR反应体系为10 μl:SYBR Green I Mixture 5 μl,正义引物0.25 μl,反义引物0.25 μl,模板cDNA 1 μl,ddH2O 3.3 μl,Rox 0.2 μl,反应条件:95℃预变性10 min,95℃变性30 s;58℃退火40 s;72℃延伸40 s,共45个循环,每个样本的RNA含量均根据各自的β-actin含量进行标准化,2-△△CT法分析BIP和CHOP相对表达量。
1.3 统计学方法应用SPSS10. 0软件包进行单因素方差分析,组间两两比较采用LSD方法。
2结果
2.1 细胞培养及鉴定倒置相差显微镜观察,细胞多呈长梭形、核大,细胞质呈现绿色,胞核呈蓝色,可见明显的肌丝纤维。免疫组化结果显示,超过98%的细胞胞质内特异性标志蛋白α-SMA表达呈阳性,提示培养细胞为VSMC,见图1。
图1 大鼠VSMC原代细胞培养、鉴定(×100)
2.2 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测结果丹参酮ⅡA、可定均可显著促进VSMC凋亡,可定组(7.11±0.21)、0.5 mg/L丹参酮ⅡA组(5.22±0.31)、1 mg/L丹参酮ⅡA组(13.67±0.25)大鼠VSMC凋亡百分率与HCY组(0.09±0.17)相比,差异显著(P<0.05,P<0.01)。
2.3 丹参酮ⅡA对VSMC BIP和CHOP mRNA表达的影响实时荧光定量PCR结果显示,与对照组比较,HCY刺激使BIP和CHOP表达上调(P<0.01);丹参酮ⅡA组和可定组VSMC BIP mRNA表达均升高,与HCY组比较差异显著(P<0.05,P<0.01),且丹参酮ⅡA上调VSMC BIP mRNA表达存在剂量依赖性;与HCY组比较,0.5 mg/L丹参酮ⅡA处理对大鼠VSMC CHOP mRNA表达无明显影响,而1 mg/L丹参酮ⅡA和可定均使CHOP mRNA表达显著升高 (P<0.01)。见表1。
表1 丹参酮ⅡA对VSMC BIP和CHOP mRNA
与对照组比较:1)P<0.01;与HCY组比较:2)P<0.05,3)P<0.01
3讨论
VSMC向血管内膜迁移、增殖是AS的主要病理特征之一,VSMC通过其表面的受体结合、摄取脂质转变为肌源性泡沫细胞,与炎症细胞、细胞外脂质及粥样坏死组织等构成AS斑块。迁移、增殖的VSMC不仅是AS斑块的主要细胞成分,而且呈合成型改变的VSMC还可分泌大量的细胞因子和生长因子,刺激更多的VSMC迁移、增殖和细胞外基质蛋白形成,促进AS病变发生发展〔2,3〕。因此,抑制VSMC的过度增殖是延缓或逆转AS病变的有效途径。HCY是蛋氨酸在体内分解代谢的中间产物,大量的流行病学调查表明高HCY血症是AS新的独立危险因素。研究证实高HCY血症致AS的作用与其促进VSMC增殖有关〔4〕。Zhang等〔5〕研究表明,HCY可通过内皮细胞中血小板源性生长因子DNA脱甲基作用而激活VSMC,促进其增殖。
BIP又称葡萄糖调节蛋白78(GRP78),是位于内质网上重要的分子伴侣,参与阻止内质网新生肽聚集、调节内质网钙稳态以及启动未折叠蛋白反应(UPR)等细胞生命过程。真核细胞的膜蛋白及分泌性蛋白质在内质网中合成后经翻译后修饰、折叠和组装,由高尔基体进一步加工后转运到膜上或分泌到胞外。当各种因素作用下新生肽链的修饰折叠与组装受到干扰,将引起未折叠蛋白在内质网中堆积,使细胞产生ERS,细胞经由上调内质网伴侣蛋白表达等相关机制启动UPR,以降低蛋白合成速率,恢复细胞内环境稳定〔6〕。存在于内质网膜上的RNA依赖性蛋白激酶样内质网激酶(PERK)、转录激活因子6(ATF6)及需肌醇酶1(IRE1)是感受内质网内应激信号的一类跨膜感受蛋白。3种跨膜感应蛋白,常态下PERK、ATF6、IRE1分别与BIP结合形成复合物,处于无活性状态。当ERS发生时,3种信号感受蛋白与BIP解离,BIP转而与未折叠蛋白相结合,促进蛋白质正确折叠,在一定程度上减轻或消除内质网内蛋白质折叠功能的负荷,因此UPR是细胞的一种适应性保护机制。当ERS过于强烈持久,大量与BIP解离的PERK、ATF6、IRE1可诱导CHOP的转录,从而激活CHOP/GADD153细胞凋亡通路。CHOP是联系ERS与细胞凋亡的重要中间信号分子,CHOP高表达可通过抑制凋亡负调节蛋白Bcl-2等多种途径诱导细胞凋亡〔7〕。
丹参酮ⅡA是从丹参中提取出来的脂溶性有效成分之一,具有改善微循环,降压,扩张冠状动脉,抑制血小板聚集,抑制血管平滑肌细胞增殖,抗心肌肥厚等广泛的药理学作用,广泛应用于心血管疾病的治疗〔8〕。前期的研究发现,ERS可能是AS时VSMC增殖失控的机制之一,丹参酮ⅡA可通过ERS途径干预兔AS病变〔9〕。本研究结果显示,丹参酮ⅡA可促进大鼠VSMC凋亡,与HCY组比较差异显著,进一步支持丹参酮ⅡA通过抑制VSMC增殖而发挥抗AS 作用的理论,ERS与丹参酮ⅡA诱导的细胞凋亡过程有关,丹参酮ⅡA诱导的VSMC凋亡过程由核转录因子CHOP介导。ERS信号转导通路被认为是除死亡受体活化和线粒体损伤外又一条新的介导细胞凋亡信号传导的通路,CHOP作为一种转录因子通过调节相关基因的表达决定细胞的生存与死亡。本实验结果表明丹参酮ⅡA可上调内质网应激蛋白BIP基因表达使凋亡信号放大,通过CHOP转录激活诱导过度增殖的VSMC凋亡,但CHOP诱导凋亡的下游信号机制还需要进一步的深入研究。
4 参考文献
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〔2013-12-16修回〕
(编辑赵慧玲/曹梦园)