表没食子儿茶素没食子酸酯增强食管癌细胞对紫杉醇的敏感性

表没食子儿茶素没食子酸酯增强食管癌细胞对紫杉醇的敏感性

袁选举陈萍王贤和邓守恒

(湖北医药学院附属人民医院肿瘤中心,湖北十堰442000)

摘要〔〕目的观察表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)体外增强紫杉醇对食管癌CaEs-17细胞化疗敏感性的作用，探讨可能的作用机制。方法实验分为空白对照组、紫杉醇组(培养液中紫杉醇终浓度为360 nmol/L)，EGCG组(培养液中EGCG终浓度为20 mg/L)、联合组(培养液中EGCG终浓度为20 mg/L，紫杉醇浓度为360 nmol/L)，各组作用24 h，CCK-8法和细胞克隆形成法检测细胞增殖抑制率和存活率，金氏公式评价二药的协同效果；流式细胞仪检测细胞凋亡率及周期分布；Transwell法检测细胞侵袭力；免疫印迹法检测P21蛋白表达水平。结果EGCG、紫杉醇均可抑制CaEs-17细胞增殖、诱导细胞凋亡、降低细胞存活率和侵袭力；减少S期细胞数量、阻断细胞周期于G1期，并能上调P21蛋白表达水平(P<0.05)，二药联用上述作用效果更为显著(P<0.01)。结论EGCG能够增强紫杉醇对食管癌CaEs-17细胞的化疗敏感性，这种作用部分是通过上调P21蛋白实现的。

关键词〔〕食管癌;表没食子儿茶素没食子酸酯；紫杉醇；化疗

中图分类号〔〕R735.1〔文献标识码〕A〔

基金项目：湖北省自然科学基金(2008CDZ022)

通讯作者：邓守恒(1973-)，男,博士,教授,硕士生导师,主要从事肿瘤药理研究。

第一作者：袁选举(1969-)，男,硕士,主治医师,主要从事肿瘤放化疗治疗研究。

Effect of epigallocatechin-3-gallate enhancing chemotherapy sensitivity of taxol on human Esophageal Cancer Line CaEs-17 in vitro

YUAN Xuan-Ju,CHEN Ping,WANG Xian-He,etal.

Center of Oncology,People Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei,China

Abstract【】ObjectiveTo observe the effect of epigallocatechin-3-gallate (EGCG) enhancing chemotherapy sensitivity of taxol on human esophageal cancer Line CaEs-17 in vitro and explore its possible mechanism.MethodsThere were four groups:control,EGCG (CaEs-17 cells were pretreated by 20 mg/L EGCG),Taxol (CaEs-17 cells were pretreated by 360 nmol/L Taxol) and EGCG /Tazol groups (CaEs-17cells were pretreated by 360 nmol/L Taxol and 20 mg/L EGCG).After treatment for 24 h,the growth and proliferation of CaEs-17 cell were detected by CCK-8 assay and clone formation test and Jin′s formula was used to assess the synergistic effects between two drugs.Cell apoptosis and phase were detected by the flow cytometry.Cell invasive ability was measured with Transwell.The expression of P21 protein was detected by Western blot.ResultsEGCG,Taxol alone inhibited cell proliferation,induced cell apoptosis,decreased cell survival rate and invasive ability,increased G1 phase cells and down-regulated the expression of P21 in CaEs-17 cells(P<0.05).The effect of Taxol combination with EGCG was better than that of Taxol,EGCG alone(P<0.01).ConclusionsEGCG could enhance chemotherapy sensitivity of taxol on human esophageal cancer Line CaEs-17 in vitro,which is partly related to the up-regulation of P21 protein on tumor cells.

【Key words】Esophageal Cancer;Epigallocatechin-3-Gallate；Taxol;Chemotherapy

紫杉醇作为食管癌常用的化疗药物之一，主要通过促进微管聚合和稳定已聚合微管使细胞分裂停止于有丝分裂期，起到抑制肿瘤细胞增殖的作用〔1〕，然而，骨髓抑制及近年来出现的多药耐药等毒副作用限制了其最大疗效的发挥。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是绿茶中含量最高，活性最强的单体〔2〕，已有的研究表明，EGCG可通过诱导细胞凋亡等方式对人鼻咽癌、肺癌、胃腺癌、前列腺癌、大肠癌及白血病等细胞产生明显的杀伤作用〔3〕。王江江等〔4〕研究还发现，EGCG与一些化疗药物联用尚能显著增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，显示其具有良好的应用前景。EGCG能否增强紫杉醇对食管癌细胞的杀伤作用尚未见有人报道。

1材料与方法

1.1 试药试剂与仪器EGCG、碘化丙啶(PI)、甲基纤维素(CPS4000)为美国Sigma产品；CCK-8试剂盒购自日本同仁公司； Transwell小室购自美国Costar公司；兔抗人P21单抗及山羊抗兔的二抗购自美国Santa Cruz公司；其他试剂均为进口分装分析纯。Mod 550型全自动酶标仪(美国Bio-Rad公司)；Mini-Prote电泳仪(美国伯乐公司)；图像采集系统(日本Olympus公司)；Epics Elite ESP型流式细胞仪(美国Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养食管癌细胞株CaEs-17购自中国科学院上海细胞生物研究所，培养于含10%灭活小牛血清的RPMI1640培养基内，于37℃、饱和湿度，5%CO2条件下培养，每2~3 d用0.25%胰酶消化，1∶2传代。

1.2.2 CCK-8法检测单独及联合给药对细胞增殖的影响取指数生长期CaEs-17细胞，以1×105个/孔接种于96孔板，37℃、饱和湿度，5%CO2条件下培养24 h后吸出原培养液，分为4组，即EGCG组(培养液中EGCG终浓度为20 mg/L)、紫杉醇组(培养液中紫杉醇终浓度为360 nmol/L)、联合组(培养液中EGCG终浓度为20 mg/L，紫杉醇浓度为360 nmol/L)，另设空白对照组(只加入RPMI1640培养基，未给予其他任何处理),EGCG和紫杉醇取1/2 IC50值，紫杉醇IC50值参照文献〔5〕，EGCG IC50值参照预实验结果，继续培养24 h后，吸去上清液，每孔加入10 μl CCK-8试剂，继续培养1 h，酶标仪检测各孔在450 nm波长下的吸光度(OD)值，代入公式计算细胞增殖抑制率。增殖抑制率=(对照组OD值-实验组OD度)/对照组OD值×100%。

1.2.3 流式法检测细胞周期及凋亡细胞分组及处理同1.2.2，收集各组作用24 h细胞，0.01 mol/L PBS0.5 ml重悬细胞，加70%乙醇1 ml，-20℃固定24 h，加入PI (终浓度为50 μl/ml)和RNA酶(终浓度为0.25 mg/ml)，室温下避光孵育30 min后流式细胞仪作DNA分析，以ModFit LT软件分析，拟合计算各时相细胞的百分比。

1.2.4 克隆形成法检测细胞增殖〔5，6〕参照文献配制半固体培养基，收集经EGCG、紫杉醇单独和联合作用24 h的各组细胞， PBS洗去药物，离心1 000 r/min×3 min，用含20%小牛血清的培养液稀释成7.0×103个/ml单细胞悬液,于24孔板预加1.2%甲基纤维素培养基1.0 ml/孔，加入单细胞悬液50 μl，使每孔细胞数为350个,每个浓度设4个复孔，混匀后置37℃，5%CO2培养箱中孵育12～14 d后于倒置显微镜下计数细胞克隆数，计算细胞存活率(给药组平均克隆数/未给药组平均克隆数×100%),实验重复三次。

1.2.5 Transwell法分析细胞侵袭性改变细胞分组及处理同1.2.2，参照试剂盒说明，以NIH3T3细胞培养液做趋化液，在Transwell上室内加入100 μl不含小牛血清的RPMI1640，37℃孵育1 h，加入上述各组细胞悬液20 μl(调细胞浓度为1.0×105个/ml),每组4个复孔。37℃ 12 h后取出滤膜，甲醇固定，HE染色。显微镜下计数滤膜外表面的细胞数，每张滤膜随机取5个视野(×200)取均值，实验重复三次，以相对侵袭抑制率表示肿瘤细胞的侵袭力，相对侵袭抑制率(%)=(对照组-实验组)/对照组×100%。

1.2.6 免疫印迹法检测P21蛋白表达细胞分组及处理同1.2.2，收集细胞，PBS洗2次，裂解，离心，收集上清，即为细胞总蛋白，进行蛋白定量，调节每份样品蛋白浓度，加等量蛋白于上样缓冲液，煮沸，在SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。电泳后转膜，依次加入P21蛋白一抗和二抗，加入底物液显色，拍照。蛋白条带用Quanti Scan软件进行密度扫描分析。

2结果

2.1 单独和联合给药对细胞增殖的抑制作用EGCG和紫杉醇单独作用CaEs-17细胞24 h对细胞产生的增殖抑制率分别为37.5%±2.2%和40.7%±2.8%,二药合用，则抑制率升高至73.8%±3.8%，合用产生抑制率大于两药单独使用(q=1.16),表明两药合用产生的抑制作用远大于两药单独相加，产生协同效果。

2.2 单独和联合给药对细胞周期分布、凋亡率的影响EGCG和紫杉醇单独或联合作用CaEs-17细胞24 h,均可明显降低S期细胞比例，升高G0-G1期细胞比例，细胞被阻滞于G0-G1期，尤其以联合用药组作用效果更为明显(P<0.01) 。二药单独或联合均可诱导细胞出现凋亡，二药联用效果更为显著(P=0.004、0.001、0.000)(表1)。

2.3 单独和联合给药对细胞存活率及侵袭力的影响EGCG和紫杉醇单独或联合作用CaEs-17细胞24 h均可明显抑制细胞克隆形成，使细胞存活率显著下降,尤其以二药合用效果更为显著(P=0.061、0.056、0.007)。细胞侵袭实验也显示出相似的作用结果，表现为与空白对照组比较，经EGCG和紫杉醇单独或联合作用后的食管癌细胞穿过基底膜的数量大大降低，二药合用后效果更为明显(P=0.084、0.071、0.005)。见表2。

表1　EGCG与紫杉醇单独和合用对食管癌细胞凋亡和

与空白对照组比较：1)P<0.05,2)P<0.01

表2　EGCG与紫杉醇单独和合用对食管癌细胞

与空白对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01

2.4 单独和联合给药对细胞P21蛋白表达的影响免疫印迹及灰度扫描结果显示， 未经处理的空白对照CaEs-17细胞内P21蛋白呈低表达(灰度值为0.301 2±0.09)。经EGCG和紫杉醇单独或联合作用24 h后，细胞内P21蛋白灰度值分别升至(0.924 5±0.18)、(0.521 6±0.17)和(1.205 9±0.27),上调率分别为(206.83±21.17)%、(83.21±10.23)%、和(294.36±19.82)%，与空白对照组比较，均有显著性差异(P=0.000、0.001、0.000)(图1)。

1，2，3，4分别为EGCG+紫杉醇组、EGCG组、紫杉醇组、空白对照组 图1　EGCG与紫杉醇单独和合用对食管癌 细胞P21蛋白表达的影响

3讨论

绿茶是我国及东南亚一带的传统饮品，绿茶中的主要成分EGCG具有显著的清除氧自由基、抗氧化、抗衰老、防紫外线、预防心血管疾病等功效〔3〕。近年来，EGCG的抗肿瘤作用逐渐引起了人们的重视，大量体内外试验表明，EGCG可通过多种途径对人体多种肿瘤产生明显的抑制增殖作用，有望开发成一种新的抗肿瘤药物〔8~10〕。

目前对EGCG抗肿瘤作用的研究多集中在诱导细胞凋亡，阻滞细胞周期，抑制肿瘤血管生成等方面，而对于EGCG联合常用化疗药物可否提高肿瘤细胞对化疗药物敏感性及降低化疗药物毒副作用等方面的研究却较少。本文将EGCG联合紫杉醇作用于体外培养的食管癌细胞株CaEs-17，采用CCK-8法和克隆形成法检测其对细胞增殖的影响，结果发现，EGCG、紫杉醇均可明显抑制细胞增殖，合用还可产生协同效应，抑制效果大于二药相加。由于克隆形成实验检测的是单个细胞的增殖能力，故而从本结果中还可看出， EGCG联合紫杉醇不仅可对处于增殖期的细胞产生杀伤作用，还可明显抑制肿瘤干细胞的增殖，这比单纯杀死或者抑制癌细胞本身具有更大的价值〔11〕。

肿瘤的发生不仅与细胞增殖失控有关，还与细胞凋亡有关。本研究采用流式细胞法检测了经EGCG、紫杉醇单独和联合作用后的细胞凋亡率并对细胞周期进行了拟合，结果显示，二药单独或联用均可诱导细胞凋亡，阻滞细胞周期于G1期，合用上述效果更为显著。由于细胞增殖的速度主要取决于细胞周期的长短，而细胞周期的长短又主要取决于G1期，G1期阻滞可使细胞增殖周期延长，部分细胞出现凋亡〔12〕。

侵袭是恶性肿瘤的主要特征之一，也是肿瘤复发转移的重要原因之一。本研究结果显示，EGCG、紫杉醇均可对食管癌细胞的侵袭能力产生明显的抑制作用，二药合用，抑制效果更加显著，提示EGCG联合紫杉醇尚能起到降低紫杉醇单药化疗后食管癌细胞易出现的复发转移等作用。

P21基因是目前已知具有最广泛活性的细胞周期抑制基因，可对细胞增殖、分化、衰老、凋亡以及损伤修复等过程产生影响〔13〕。研究表明，P21的表达缺失可引起肿瘤的生长失控、更差的分化和预后等，而导入外源P21基因后，上述现象又可得到有效抑制〔14〕。本文经EGCG、紫杉醇单独和联合作用后的食管癌细胞中P21蛋白表达出现明显上调，表明这两种药物合用可能就是通过激活P21通路来发挥抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和阻止细胞侵袭等药理作用的，但具体的分子机制伤仍需进行深入研究。

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〔2013-12-29修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)