硫酸锌预处理对成年大鼠缺氧/复氧心肌细胞超微结构的影响

侯伟波，张永国，王颖，王海英，喻田

（遵义医学院麻醉学系，贵州遵义563003）

硫酸锌预处理对成年大鼠缺氧/复氧心肌细胞超微结构的影响

侯伟波，张永国，王颖，王海英，喻田

（遵义医学院麻醉学系，贵州遵义563003）

目的研究硫酸锌预处理对成年大鼠缺氧/复氧心肌细胞超微结构的影响。方法分离培养SD成年大鼠心肌细胞，建立心肌细胞缺氧/复氧损伤模型，将细胞随机分为正常组（N组）、缺氧/复氧组（H/R组）、缺氧预处理组（HP组）、硫酸锌（ZnSO4）预处理组（ZnP组），分别进行相应处理，然后用透射电镜对各组心肌细胞超微结构进行观察，并进行线粒体评分。结果N组、HP组、ZnP组超微结构优于H/R组，且线粒体评分较H/R组低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；HP组、ZnP组超微结构变化相似，且两组线粒体评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05），但均高于N组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论缺氧/复氧可造成成年大鼠心肌细胞超微结构的损伤，ZnSO4预处理、缺氧预处理均能减轻该损伤，且二者效果相当。

肌细胞，心脏；硫酸锌；大鼠；线粒体；超微结构；缺氧/复氧损伤

心肌缺血再灌注损伤（MIRI）是目前影响心脏手术成功率和患者术后恢复的重要因素之一，因此，国内外学者对其研究也出现了多元化、多层次性，使预防MIRI的措施层出不穷。随着相关研究的深入，微量元素锌在减轻MIRI中的重要作用逐渐被人们所重视。Xu等[1]研究发现，在大鼠心脏上，锌可通过增强再灌注损伤补救激酶（RISK）通路活性在后处理保护心肌作用时扮演重要角色，但其通过预处理产生心肌保护的作用却少见报道。因此，本研究拟通过建立大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型，选择硫酸锌（ZnSO4）直接作用于心肌细胞，观察微量元素锌预处理对缺氧/复氧心肌细胞超微结构的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物无特定病原体（SPF）级健康雄性SD大鼠6只，体质量250～300 g，16～20周龄，由第三军医大学大坪医院医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（渝2012-0005）。

1.1.2 主要试剂Hcylon M199培养基、索来宝N-2-羟-酸哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）、层黏连蛋白、肌酸、牛磺酸、牛血清清蛋白（BSA）、乙二醇双（2-氨基乙醚）四乙酸（EGTA）、Ⅱ型胶原酶等试剂均购自美国Sigma公司，其他均为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器langendorff离体灌注系统，Thermo CO2培养箱，Thermo CO2缺氧培养箱，H7500透射电子显微镜（日立公司），CyberScan310型pH计（美国优特EUTECH），去离子水处理器（美国Mili QA），BS224S电子天平（德国Sartorius），5804R型Eppendorf台式高速离心机（德国Eppendorf）。

1.2 方法

1.2.1 心肌细胞分离培养心肌细胞的分离培养参照文献[2]进行，具体步骤如下：（1）SD大鼠腹腔注射肝素（250 U/kg）、戊巴比妥钠（40 mg/kg），待大鼠麻醉后将其固定于宰鼠板上，75%乙醇消毒皮肤，沿剑突下肋缘迅速剪开腹壁，剪开膈肌，沿两侧腋前线剪开胸壁翻向头侧，于心脏根部保留主动脉3～4 mm处剪下心脏，立即放入提前加热至37℃750 μmol/L Ca2+液中轻轻挤压心脏2～3次，使心腔残留的血液排尽。（2）迅速用镊子于液面下夹起大鼠心脏主动脉根部固定于langendorff离体灌注系统的灌注针上（流量设置为9 mL/g心脏组织）；依次灌注经氧和的37℃、750 μmol/L Ca2+液2 min，100 μmol/L EGTA 4 min，心肌细胞酶消化液7～8 min。（3）灌注完成后于主动脉根部剪下心脏，从主动脉向心尖剪开心肌，放入无菌烧杯中，加入含有1%BSA的心肌细胞酶消化液5 mL，于37℃恒温水浴摇床在氧合情况下手动振荡，每次5 min，200目金属滤网过滤收集在无菌离心管里，置于37℃恒温水浴箱内自然下沉，重复4～5次，收集细胞沉淀，酶洗脱洗涤细胞沉淀3次，最后用改良型M199培养基洗涤3次。（4）用0.4%台盼蓝1∶1染色，倒置相差显微镜下观察心肌细胞形态，评价存活率（80%以上），计数细胞，将细胞以每毫升106个的密度均匀铺于6孔板，每孔2 mL。培养3 h后更换培养基，去除未贴壁细胞。继续培养过夜，然后进行随机分组处理。

1.2.2 实验分组及处理将培养的心肌细胞随机分为四组。（1）正常组（N组）：于37℃中95%空气和5%CO2正常培养箱中持续培养105 min；（2）缺氧/复氧组（H/R组）：将正常培养的心肌细胞置于95%N2和5%O2缺氧培养箱中缺氧45 min后重新置于正常培养箱中培养60min；（3）缺氧预处理组（HP组）：首先将细胞进行3次短时间缺氧（每次2 min），然后在每次短时间缺氧后分别复氧2、3、5 min，缺氧复氧处理同H/R组；（4）ZnSO4预处理组（ZnP组）：先给正常培养的细胞中加入终浓度为10μmol/L的ZnSO4水溶液，正常培养30min，其余处理同H/R组。

1.2.3 取材及透射电镜观察各组细胞在培养结束之后立即用细胞刮轻轻将细胞刮下，收集于1.5 mL EP管中，1 200 r/min、4℃离心10 min，弃上层培养基，沿管壁缓慢加入4℃预冷的4%戊二醛溶液，对标本进行预固定，然后送至重庆医科大学电镜室进行后续的后固定、脱水、包埋、聚合、切片、染色、观察。每个标本观察6～10个视野，对每个标本的超微结构变化进行比较，并且每个标本选取100个线粒体进行评分。线粒体评分标准参照Flameng分级分为0～4级，分别为0～4分。见表1。

表1 线粒体Flameng评分标准

1.3 统计学处理应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计数资料以±s表示，组间采用单因素方差（ANOVA）分析，方差齐选用LSD法，方差不齐选用Dunnett T3法行组间两两多重比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠心肌细胞超微结构观察电镜下心肌细胞的损伤主要归纳为以下4点：（1）膜系统损伤（线粒体、肌浆网肿胀、肌膜破裂）；（2）收缩成分破坏；（3）细胞内水肿；（4）糖原颗粒减少。

2.1.1 N组心肌细胞超微结构描述N组细胞质中有丰富的线粒体，呈圆形或椭圆形，且排列整齐。线粒体嵴密集，充满整个线粒体腔，嵴上附着大量基质颗粒；细胞核位于细胞中央，呈长杆状，核膜完整，两层核膜清晰可辨；细胞纵切面可见细胞质充满纵行排列的肌原纤维：I带、A带、H带与M线均清晰可辨，形成明暗相间的肌节结构；核周与肌丝间有少量糖原颗粒；其他细胞器改变均不明显。见图1A。

2.1.2 H/R组心肌细胞超微结构变化H/R组心肌细胞线粒体排列紊乱，基膜基板不清楚，线粒体普遍肿胀、外膜不完整，嵴减少、不规则或断裂成絮状，部分线粒体损伤严重、破裂、溶解，甚至空泡或囊泡化；细胞核形状不规则，核内染色质凝集，核膜溶解消失；心肌肌原纤维排列紊乱，大面积断裂融解消失，肌节结构不清，肌丝溶解减少，Z线可见异常收缩带；肌浆网横小管扩张，偶见胞内脂滴形成。见图1B。

2.1.3 HP组心肌细胞超微结构变化HP组心肌细胞线粒体大部分轻度肿胀，嵴模糊，嵴间出现透亮低密度影，线粒体膜完整，细胞核轻度皱缩，核膜完整；肌丝轻度稀疏，偶见断裂溶解，肌丝排列基本整齐，Z线较清；肌浆网横小管轻度扩张。见图1C。

2.1.4 ZnP组心肌细胞超微结构变化ZnP组心肌细胞线粒体大部分轻度肿胀，嵴排列稀疏，嵴间可见轻度透亮区，肌丝改变不明显，细胞核轻度改变，肌浆网横小管轻度扩张。见图1D。

图1 各组心肌细胞超微结构电镜观察

2.2 大鼠心肌细胞线粒体评分结果根据Flameng评分标准对各组线粒体进行评分，N组心肌细胞线粒体结构正常，评分以0分为主；H/R组心肌线粒体损伤以3～4分为主，损伤最严重；HP组和ZnP组评分以2～3分为主，损伤程度介于N组和H/R组之间。N组、HP组、ZnP组线粒体评分[（0.25±0.44）、（1.13±0.44）、（1.23±0.45）分]较H/R组[（3.33±0.65）分]低，差异有统计学意义（P＜0.05）；HP组与ZnP组线粒体评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05），但均高于N组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

目前研究认为，缺血/药物预处理是缺血心脏强而有效的内源性保护现象，可以减轻缺血再灌注后心肌坏死与心肌功能障碍，减少恶性心律失常的发生，促进血管再生[3]。内源性心脏保护的机制主要是通过诱导触发多种内因子释放，经多条细胞内信号转导途径的介导[如：由磷脂酰3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）、P38、c-Jun氨基末端激酶（JNK）及细胞外信号调节激酶（ERK）等组成的RISK及蛋白激酶C（PKC）等途径]，作用于多种效应器，影响氧自由基产生、钙超载、心肌细胞凋亡等缺血再灌注损伤的关键环节而发挥心肌细胞保护作用[4]。近年来外源性锌预处理用于对抗缺血再灌注对心肌损伤的研究越来越多，锌在药物预处理中的显著效果越来越受到重视。

锌作为人体内重要的微量元素，在人体各项生命活动中发挥着重要作用。锌离子是构成机体各种酶、蛋白、转录因子等结构和功能的基础[5]，锌与生物膜的稳定性、抗氧化活性、基因表达调控、细胞免疫、细胞凋亡及其毒性作用等相关[6]。因此，锌离子在体内的失衡和紊乱都会对机体产生严重损害。目前随着研究的深入，有研究者发现锌预处理心肌可对缺血再灌注心肌产生改善心肌能量代谢、减轻钙超载，抑制炎性反应的作用[7]；锌与维生素E同食可抑制抗凋亡基因Survivin[8]、Caspase-3[9]与心肌凋亡促进因子Smac[10]的表达，从而达到抑制心肌细胞凋亡的作用。锌指蛋白ZFP580[11]、心肌缺血预适应上调蛋白1（Mipu1）[12]等锌依赖蛋白的上调均可在MIRI修复过程中发挥心肌保护作用。在临床医疗中，宋瑞等[13]研究发现，使用葡萄糖酸锌片进行术前补锌能减轻先天性心脏病患儿体外循环心内直视手术MIRI。以上几项研究结果的发现都与微量元素锌的存在密不可分，可见锌在对抗MIRI过程中有着举足轻重的地位。

细胞的超微病理改变是反映细胞损伤和修复最直观、最有效的指标[14-15]。本研究电镜超微结构变化显示，H/R组心肌细胞出现线粒体排列紊乱，基膜基板不清楚，线粒体普遍肿胀，空泡或囊泡化，外膜不完整，嵴减少、不规则或断裂成絮状，部分线粒体损伤严重、破裂、溶解；细胞核形状不规则，核内染色质凝集，核膜溶解消失，心肌肌原纤维排列紊乱且大面积断裂融合消失，肌节结构不清，肌丝溶解减少，Z线可见异常收缩带，肌浆网扩张等一系列的损伤表现。这一结果与徐鹏等[16]的研究结果相似，说明本实验的缺氧/复氧模型成功建立。ZnSO4预处理之后的心肌细胞在进行缺氧/复氧以后，心肌细胞超微结构的损伤程度较单纯H/R组轻。说明本实验从形态学角度证明硫酸锌预处理对原代培养成年大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤具有一定的保护作用。

缺血再灌注可通过多种途径造成心肌细胞线粒体损伤，线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用[17]。因此，线粒体超微结构的改变在心肌细胞缺氧/复氧损伤中是评判心肌细胞损伤程度的重要指标。而线粒体Flameng评分正是对线粒体超微结构改变的半定量评定。本研究结果中ZnP组线粒体Flameng评分明显低于H/R组。这一结果从形态学角度证明了锌预处理对心肌细胞缺氧/复氧造成的线粒体损伤具有一定的保护作用。然而其具体保护机制却错综复杂，本研究未对其作用机制进行研究分析，因此，还需要在以后的科研工作中进一步挖掘探索。

与HP组比较，ZnSO4对心肌细胞超微结构产生了与其相当的保护效果。因此，从形态学角度推测，ZnSO4预处理可替代缺氧预处理，对缺氧/复氧心肌细胞产生保护作用。但是这2种预处理方式之间是否通过共同的作用机制产生保护作用还有待进一步研究。

综上所述，缺氧/复氧可造成成年大鼠心肌细胞和线粒体超微结构的损伤，ZnSO4预处理能够明显减轻缺氧/复氧对心肌细胞及线粒体超微结构的损伤，而且保护效果与缺氧预处理效果相似，证实微量元素锌可改善缺氧复氧对心肌细胞产生的损伤，具有保护心肌的作用。

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Effects of zinc sulfate pretreatment on cardiomyocytes ultrastructure of adult rats with hypoxia/reoxygenation injury

Hou Weibo，Zhang Yongguo，Wang Ying，Wang Haiying，Yu Tian
（Department of Anesthesiology，Zunyi Medical College，Guizhou，Zunyi 563003，China）

ObjectiveTo approach the effects of zinc sulfate pretreatment on cardiomyocytes ultrastructure of adult rats with hypoxia/reoxygenation injury.MethodsAdult SD rats cardiomyocytes were cultured in vitro and hypoxia/reoxygenation injury models were established，which were randomly divided into 4 groups，including the normal group（group N），the hypoxia/reoxygennation group（group H/R），the hypoxic preconditioning group（group HP）and the znic sulfate（ZnSO4）preconditioning group（group ZnP）.Each group was managed with different intervening measures.In the end，the ultra-structure of cardiomyocytes in each group after hypoxia/reoxygenation could be observed by a transmission electron microscope and scored with mitochondria.ResultsThe ultrastructure of group N，group HP and group ZnP were much better than those of H/R group，and the mitochondria scores of the above-mentioned three groups were lower than those of group H/R whose difference was statistically significant（P＜0.05）.There was no statistical significance in ultrastructure variation and mitochondria score between the group HP and the group ZnP（P＞0.05），but these results were higher than those of group N，whose difference was statistically significant（P＜0.05）. ConclusionHypoxia/reoxygenation is able to cause injury to the cardiomyocytes′ultrastructure of adult rats.ZnSO4precondioning could reduce the cardiomyocytes ultrastructure damage，and the effect is equal to traditional hypoxic preconditioning.

Myocytes，cardiac；Zinc sulfate；Rats；Mitochondria；Ultrastructure；Hypoxia/reoxygennation injury

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.05.007

:A

:1009-5519（2015）05-0657-03

2014-11-25）

贵州省科技支撑计划项目（黔科合SY[2011]3015）。

侯伟波（1989-），男，陕西咸阳人，硕士研究生，主要从事心肌保护研究；E-mail：806752595@qq.com。通讯作者：王海英（E-mail：wanghaiting-8901@163.com）。