米诺环素对大鼠脊髓挤压伤后运动功能恢复的影响

米诺环素对大鼠脊髓挤压伤后运动功能恢复的影响

郑州大学基础医学院郑州450000

【摘要】目的探讨米诺环素对大鼠脊髓挤压伤后运动功能恢复的影响。方法成年Sprague-Dawley(SD)大鼠36只，分为空白对照组：只打开脊柱椎板，不损伤脊髓；米诺环素治疗组：制作脊髓挤压伤模型，腹腔注射米诺环素；盐水对照组：制作脊髓挤压伤模型，腹腔注射等剂量的生理盐水。于脊髓挤压伤后第3天取大鼠脊髓标本，进行组织水肿、损伤面积的测量，并行组织切片，进行细胞凋亡Caspase-3染色，观察细胞凋亡情况。同时于各个时间点进行大鼠后肢运动功能评分(basso-beattie-bresnahan，BBB评分)。结果与生理盐水组比较，米诺环素治疗组损伤面积更小，细胞凋亡数量更少，组织水肿更轻，运动功能恢复更好。结论米诺环素可以促进大鼠脊髓挤压伤后运动功能的恢复。

【关键词】脊髓挤压伤；米诺环素；细胞凋亡；组织水肿；损伤面积

通讯作者仓宝成李付广()

【中图分类号】R-332

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)致残率极高，常导致患者运动、感觉功能丧失。脊髓损伤后的病理生理演变包括原发性损伤和继发性损伤，其中多种因素参与继发性损伤：包括水肿、自由基、炎症反应、兴奋性毒性等[1]。继发性损伤一直是神经科学研究的重点。米诺环素是一种广谱抗菌的四环素类抗生素，研究报道米诺环素还具有抑制炎症反应、抗凋亡、调节代谢等方面的作用[2]。本实验采用大鼠T8-9节段脊髓挤压伤模型，通过腹腔早期给予米诺环素，探讨米诺环素对大鼠脊髓挤压伤的修复作用。

1材料与方法

1.1实验动物及分组SD雄性大鼠36只，由郑州大学实验动物中心提供，体质量200～220 g。将动物分为假手术组、盐水对照组和米诺环素治疗组，每组12只。假手术组：仅进行椎板去除术；盐水对照组：脊髓挤压伤后，定时行腹腔注射盐水对照；米诺环素治疗组：脊髓挤压伤后，定时行米诺环素腹腔注射治疗。各组动物于术后0、1、3、5、7 d进行运动功能评分。本实验的所有操作符合153医院动物实验伦理委员会的要求。

1.2模型制作脊髓挤压伤模型：大鼠用1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，俯卧位固定，背部剃毛，以T8棘突为中心，切开皮肤3～4 cm，分离皮下及椎旁肌，暴露T7-9的椎板和棘突，于体视显微镜(Olympus ZX-16 s)下用咬骨钳小心咬除T8节段的棘突和椎板，暴露T8脊髓并保持硬脊膜完整。用特制的镊尖间距0.5 mm的夹力恒定的镊子小心插入脊髓两侧间隙中夹住脊髓20 s(假手术对照组仅行T8锥板去除术)，缝合肌肉和皮肤，碘伏消毒伤口。术后每日人工辅助排尿2 次，排除伤口或尿路感染的动物。

1.3给药剂量及途径米诺环素(Sigma 公司)用无菌盐水配制成45 mg/ mL浓度，于脊髓挤压伤术后0 h、12 h、1 d、2 d、3 d按照45 mg/kg的剂量每天腹腔注射1次。盐水对照组在同样的时间点腹腔注射等同体积的灭菌生理盐水。

1.4组织准备各组动物于相应时间点取材，假手术组于椎板去除术后1 d取材。大鼠在给予过量的1%戊巴比妥钠麻醉后，开胸行左心室灌注，先灌注100 mL生理盐水冲洗体循环内的血液，然后灌注用0.1 mol/L磷酸缓冲液配置的4%多聚甲醛400 mL固定组织，取出以损伤为中心的2 cm脊髓组织，将组织置于25%蔗糖中脱水，直至标本沉底。行连续矢状冰冻切片,切片厚度为20 μm,分贴成10套。

1.5组织学染色选取1套组织标本切片，HE染色，观察损伤面积；另选取1套组织标本切片，室温晾干，PBS洗3次，行Caspase-3一抗(1∶200 Abcam)孵育，室温过夜，PBS洗片3次，加入二抗(1∶1000 Molecular Probes)室温孵育2 h，50%甘油封固。荧光显微镜(BX50 Olympus)观察、照片以统计。

1.6脊髓水肿将大鼠用1%戊巴比妥钠过量麻醉后，左心室灌注生理盐水100 mL，去除椎板，取以损伤部位为中心1 cm长的脊髓组织，称重后经80 ℃烘箱12 h，再次称重，分析干湿质量比。

1.7BBB评分按照BBB评分系统标准，采用双盲法，于术后各时间点对大鼠后肢运动功能进行评分。

2结果

2.1脊髓组织水肿假手术组脊髓组织干湿质量比为0.42±0.003；脊髓挤压伤后盐水治疗组3 d的干湿质量比为0.31±0.008；而脊髓挤压伤后米诺环素治疗组3 d的干湿质量比为0.35±0.007。与盐水治疗组相比，米诺环素治疗组的水肿程度在第3天明显减轻(P< 0.05)。见图1。

注：与盐水组比较，米诺环素组的组织水肿更轻，*P<0.05

图1脊髓挤压伤后3 d脊髓组织干湿质量比

2.2HE染色结果研究报道，脊髓挤压伤后，第3天时损伤面积最大[3]；由此我们取脊髓挤压伤后3 d的组织切片，进行HE染色，结果显示：米诺环素治疗组损伤面积明显小于盐水对照组(P<0.05)。见图2。

图2脊髓挤压伤后3 d损伤面积a：假手术组；b：盐水治疗组；c：米诺环素治疗组；d：损伤面积统计图；bar=500 μm，*P<0.05

2.3细胞凋亡情况将脊髓挤压伤后3 d和7 d的组织切片进行Caspase-3染色，结果显示：假手术组Caspase-3阳性细胞很少，米诺环素治疗组Caspase-3阳性细胞数明显少于盐水治疗组，说明米诺环素可以减少细胞凋亡。见图3。

图3脊髓挤压伤后3 d Caspase-3染色结果a：假手术组；b：盐水治疗组；c：米诺环素治疗组；d：Caspase-3阳性细胞数统计图；bar=50 μm，*P<0.05

2.4BBB评分按照BBB评分细则对实验动物于各时间点进行评分，假手术组动物运动功能未受影响；米诺环素治疗组和盐水对照组于挤压伤后0、1和3 d无明显差异(P>0.05)，于伤后5、7 d可见，米诺环素组运动功能明显好于盐水对照组(P<0.05)。见图4。

图4　脊髓挤压伤后不同时间点BBB评分

3讨论

脊髓损伤后，米诺环素是一种半合成的四环素类药物，最近的研究发现，其在炎症反应、血管新生、细胞凋亡等方面起重要作用；冯晓波等[4]报道，米诺环素可通过减少胶质瘢

痕的形成，促进脊髓不完全损伤后的运动功能恢复；段冰玉等[5]研究报道，米诺环素可以促进神经保护性因子BDNF、NT-3的表达，进而对神经起保护作用。本实验采用脊髓挤压伤模型，通过检测脊髓损伤后的水肿程度、细胞凋亡、损伤面积方面，确定米诺环素可以减轻组织水肿、减少细胞凋亡、减小损伤面积，进而促进大鼠脊髓挤压伤后运动功能恢复。

综上所述，本文为米诺环素对脊髓挤压伤的保护机制提供了进一步的依据，为临床应用提供了基础。

参考文献4

[1]Oyinbo CA.Secondary injury mechanisms in traumatic spinal cord injury:a nugget of this multiply cascade[J].Acta Neurobiol Exp (Wars),2011,71(2):281-299.

[2]Takeda M,Kawaguchi M,Kumatoriya T,et al.Effects of minocycline on hind-limb motor function and gray and white matter injury after spinal cord ischemia in rats[J].Spine,2011,36(23):1 919-1 924.

[3]刘爱刚,赵杰,王聪,等.大剂量甲基强的松龙对大鼠急性脊髓半切损伤的早期神经保护作用[J].脊柱外科杂志,2010,8(4):219-223.

[4]冯晓波,任航空,杨述华.米诺环素对不完全脊髓损伤大鼠神经功能修复的影响[J].中国医院药学杂志,2012,32(10):744-747.

[5]段冰玉,周厚纶,任航空.米诺环素对不完全脊髓损伤大鼠脊髓BDNF和NT-3表达的影响[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2013,22(5):406-410

(收稿2014-11-08)