丙型肝炎病毒CTL-Th表位嵌合DNA疫苗的构建

李德周，段志良，郭江龙，王思娜，刘慧芳，王志斌，钟晓芝，陈永平，文金生

（1.宁波市第二医院 肝病科，浙江 宁波 315000；2.温州医科大学 虫媒病毒研究所，浙江 温州325035；3.温州医科大学附属第一医院 感染科，浙江 温州 325015）

·论 著·

丙型肝炎病毒CTL-Th表位嵌合DNA疫苗的构建

李德周1，段志良2，郭江龙2，王思娜2，刘慧芳2，王志斌2，钟晓芝2，陈永平3，文金生2

（1.宁波市第二医院 肝病科，浙江 宁波 315000；2.温州医科大学 虫媒病毒研究所，浙江 温州325035；3.温州医科大学附属第一医院 感染科，浙江 温州 325015）

目的：构建丙型肝炎病毒（HCV）CTL-Th表位嵌合DNA疫苗并探讨其体内免疫学效应。方法：基于我们前期从HCV中鉴定的4条HLA-A*0201限制性CTL（细胞毒性T细胞）表位（NS4b78-86、NS5a367-375、C181-189和NS2172-180），2条HLA-A*1101限制性CTL表位（NS3609-617和NS5b251-259），1条HLA-A*2402限制性CTL表位（NS5b382-390）和2条Th（辅助性T细胞）表位（P73-15和NS5A276-288），合成编码串联CTL表位和Th表位的基因并克隆入真核表达质粒pcDNATM3.1/myc-His（-）A；阳性重组质粒分别免疫HLA-A*0201、HLA-A*1101和HLA-A*2402转基因小鼠，采用ELISPOT实验和CTL杀伤实验检测小鼠脾细胞内单个CTL表位特异性T细胞的水平及其杀伤靶细胞的效应。结果：合成了含有Kozak序列和编码Igκ信号链序列、7条CTL表位、2条Th表位的基因序列并顺利克隆入了真核表达质粒。阳性重组质粒免疫三种转基因小鼠后，采用ELISPOT实验检测到小鼠脾细胞内存在单个CTL表位特异性分泌IFN-γ的CTL，后者可杀伤负载单个CTL表位的脾细胞。结论：成功构建了可诱导CTL反应的HCV的CTL-Th表位嵌合DNA疫苗。

丙型肝炎病毒；细胞毒性T细胞；表位；DNA疫苗；小鼠

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）为单股正链RNA病毒，其基因组翻译3个结构蛋白（C、E1和E2）和七个非结构蛋白（P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）。HCV感染既可引起急性肝炎，也可导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌[1]。据估计，目前全球有1.8亿人已感染了HCV。目前，针对丙型肝炎有效的治疗方法有两种：联合使用聚乙二醇化干扰素-α和利巴韦林及联合使用Simeprevir和Daclatasvir，但前者只能治愈不到50%的患者，而后者高昂的价格也限制了其在大部分患者中的应用。目前，研发有效的疫苗仍是防治HCV感染的关键。

大量研究表明，HCV特异性CTL（细胞毒性T细胞，活化的CD8+T细胞）反应对于控制HCV感染和清除靶细胞内HCV至关重要[2]。因此，基于CTL表位的新型疫苗是目前HCV疫苗研发的一个方向。在前期研究中，我们从HCV中鉴定出了7条分别受HLA-A*0201、HLA-A*1101和HLA-A*2402限制的CTL表位[3-5]和2 条Th（辅助性T细胞，活化的CD4+T细胞）表位（尚未发表）。HLA-I类基因A基因座位的三个等位基因（HLA-A*0201、HLA-A*1101和HLA-A*2402）在不同肤色、种族人群中总覆盖率均超过80%。因此，含有上述三种分子限制的CTL表位的候选疫苗具有广泛的人群覆盖率，具有通用型。本研究拟基于我们前期鉴定的7条CTL表位和2条Th表位构建CTL-Th表位嵌合DNA疫苗，并基于HLA转基因小鼠研究其诱导CTL反应的效应。

1 材料和方法

1.1 材料 委托上海强耀多肽生物公司合成我们之前鉴定的7条CTL表位[NS4B78-86（SMMAFSAAL），NS5A367-375（TVSSALAEL），C181-189（LLSCLTTPV），NS2172-180（VLQAGLIRV），NS3609-617（ITLTHPITK），NS5B251-259（QVIRSLTER），NS5B382-390（YYLTRDPTI）]，其纯度均大于95%。真核表达质粒pcDNATM3.1/myc-His（-）A购自美国Invitrogen公司。限制性核酸内切酶Xba I和Hind I I I购自北京艾德来生物科技有限公司。小鼠IFN-γ ELISPOT（酶联免疫斑点实验）试剂盒购自荷兰U-CyTech生物公司。CTL杀伤试剂盒（LDH释放法）购自美国Promega公司。HLA-A*0201转基因小鼠购自美国Jackson实验室，HLA-A*1101转基因小鼠和HLA-A*2402转基因小鼠购自美国Taconic公司。

1.2 CTL-Th表位嵌合基因的合成 委托北京六合华大基因科技股份有限公司合成编码多个串联CTL表位和Th表位的基因（已进行小鼠密码子优化，命名为HCV-Meg），HCV-Meg基因片段从5’端到3’端分别为保护性碱基，Xba I酶切位点，Kozak序列，Ig κ信号链序列，编码串联的上述9条表位和1条广谱性Th表位（PADRE表位，序列为AKFVAAWTLKAAA）的核苷酸序列（编码表位的核苷酸之间为编码连接桥的核苷酸），Hind I I I酶切位点和保护性碱基。

1.3 HCV-Meg克隆入真核表达载体 经Xba I和Hind I I I双酶切并回收的HCV-Meg与经双酶切处理并回收真核表达质粒pcDNATM3.1/myc-His（-）A在T4连接酶作用下连接，然后转化入感受态大肠杆菌DH5α。培养已转化的大肠杆菌后提取质粒，双酶切处理质粒并采用1%琼脂糖电泳。双酶切正确的重组质粒送公司测序以确定重组质粒所携带的序列是否为完全正确的多表位串联基因。经双酶切处理并电泳和测序证明正确的阳性重组质粒[命名为pcDNATM3.1/myc-His（-）A-HCV-Meg]用于免疫3种转基因小鼠。

1.4 重组质粒免疫转基因小鼠 重组质粒pcDNATM3.1/myc-His（-）A-HCV-Meg溶于PBS液至终浓度为1 mg/mL，分别用于免疫HLA-A*0201转基因小鼠、HLAA*1101转基因小鼠和HLA-A*2402转基因小鼠。转基因小鼠为6～8周龄，每种转基因小鼠6只。50 μg重组质粒（溶于50 μL PBS）注射到小鼠胫骨前肌内，1周后，加强免疫2次（间隔1周）。第3次免疫1周后，颈椎脱臼法处死小鼠，制备脾细胞悬液。采用小鼠IFN-γ ELISPOT实验检测脾细胞内CTL表位特异性分泌IFN-γ的T细胞的水平。

1.5 小鼠IFN-γ ELISPOT实验 采用小鼠IFN-γ ELISPOT检测重组质粒免疫的转基因小鼠脾细胞内CTL表位特异性分泌IFN-γ的T细胞的水平。简述过程如下：将上述脾细胞浓度调整到5×106细胞/mL培养基，按照每孔100 μL的量加入预包被的ELISPOT 96孔板中并设置无肽孔（不加任何表位）和肽刺激孔（加入终浓度为20 μg/mL的不同的CTL表位）。ELISPOT板在37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h后，弃去每孔细胞液并洗涤每孔。每孔加入新鲜配制的生物素化的抗小鼠IFN-γ的检测单抗，于37 ℃孵育1 h。洗板，每孔加入新鲜配制的HRP标记的链霉亲合素，于37 ℃孵育1 h。洗板，每孔加入新鲜配制的显色液，于37 ℃显色20 h。采用自来水洗板以终止反应，采用ELISPOT读板仪对每孔棕色斑点进行计数。每一个斑点代表1个斑点形成细胞（SFC），也可以说1个CTL表位特异性分泌IFN-γ 的T细胞。表位特异性T细胞的频率表示为IFN-γ SFCs/5×105细胞。

1.6 准备靶细胞 处死未免疫的转基因小鼠，制备脾细胞悬液，采用冰冷的枸橼酸缓冲液（0.131mol/L枸橼酸和0.666 mol/L磷酸氢二钠，pH 3.2，4 ℃）处理脾细胞90 s，然后加入不同的CTL表位于37 ℃孵育2 h。最后，枸橼酸处理的脾细胞和枸橼酸处理并负载CTL表位的脾细胞作为靶细胞用于CTL杀伤实验。

1.7 CTL杀伤实验 CTL杀伤实验[乳酸脱氢酶（LDH）释放法]用于检测重组质粒免疫小鼠的脾细胞杀伤未负载CTL表位及负载CTL表位的脾细胞的效应。按照试剂盒说明书，整个实验在96孔圆底培养板中进行。来自重组质粒免疫小鼠的脾细胞用作效应细胞，枸橼酸处理的脾细胞及枸橼酸处理后并负载CTL表位的脾细胞作为靶细胞。实验孔（Experimental）同时加入效应细胞和靶细胞，每孔靶细胞量固定为1×104细胞（50 μL培养基），设置3组效应细胞/靶细胞比率为10∶1，5∶1，1∶1。除了实验孔，还设置了效应细胞自发释放孔（ES）、靶细胞自发释放孔（TS）、靶细胞最大释放孔（TM）、容积校正孔（VC）和培养基背景孔（CM）。每孔总液体量为100 μL。在37 ℃孵育8 h后（第7.5小时，TM孔和VC孔加入10 μL细胞裂解液）。培养板于400×g离心4 min后，50 μL上清转移到新的96孔板，加入检测试剂，于37 ℃反应20 min。采用酶标仪测定液体490 nm的吸光度值。针对每个效/靶比，效应细胞对靶细胞的百分杀伤率计算公式如下：

1.8 统计学处理方法 采用SPSS 17.0统计学软件。结果表示为mean±sD，Student t-test用于统计实验组间的统计学差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组质粒结构图 基于7条CTL表位和2条Th表位序列，合成了编码串联表位的CTL-Th表位嵌合基因（HCV-Meg）（经过小鼠密码子优化）并拟克隆入真核表达质粒pcDNATM3.1/myc-His（-）A。9条表位信息见表1。HCV-Meg基因片段全长（含保护性碱基）为423 bp。如图1-2所示：HCV-Meg基因片段从5’端到3’端分别为保护性碱基（ACA），Xba I酶切位点（TCTAGA），Kozak序列（GCCGCCACC），Ig κ信号链序列（ATGGGCATGCAGGTGCAGATCCAGAGCCTGTT CCTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGCAGCAGGGGC），编码串联的上述9条表位和1条广谱性Th表位（PADRE，AKFVAAWTLKAAA）的核苷酸序列（编码表位的核苷酸之间为编码连接桥的核苷酸），Hind I I I酶切位点（AAGCTT）和保护性碱基（TGT）。编码的串联表位之间的连接桥分别为“A”、“K”、“N”、“NA”、“G”、“NA”。

2.2 重组质粒双酶切电泳图 采用Xba I和Hind I I I 对HCV-Meg和pcDNATM3.1/myc-His（-）A分别进行双酶切，将回收的基因片段和质粒在T4连接酶作用下连接，然后将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α。培养转化的大肠杆菌，提取质粒，采用Xba I和Hind I I I双酶切质粒，酶切产物进行琼脂糖电泳。如图3所示，第1和第4泳道为核酸marker，第2泳道为重组的pcDNATM3.1/myc-His（-）A，第3泳道为双酶切重组的pcDNATM3.1/myc-His（-）A，很明显，从重组的pcDNATM3.1/myc-His（-）A质粒中双酶切出了1 条400 bp左右的条带，与插入的目的条带大小一致。

表1 前期鉴定的CTL表位和Th表位的信息

图1 CTL-Th表位嵌合基因序列

图2 重组质粒pcDNATM3.1/myc-His（-）A的图谱

图3 重组质粒双酶切电泳图

2.3 重组质粒测序图 将上述经双酶切初步验证正确的重组质粒送苏州金唯智生物科技有限公司测序，如图4测序结果所示：重组质粒中插入的核苷酸序列与我们委托生物公司合成的CTL-Th表位嵌合基因序列完全一致，无碱基丢失、插入或突变。将双酶切电泳和测序完全正确的阳性重组质粒命名为pcDNATM3.1/myc-His（-）A-HCV-Meg，并大量提取该质粒以用于后续研究。

2.4 ELISPOT结果 重组质粒pcDNATM3.1/myc-His （-）A-DENV1-Meg分别用于免疫HLA-A*0201转基因小鼠、HLA-A*1101转基因小鼠和HLA-A*2402转基因小鼠。在最后一次免疫1周后，我们采用了ELISPOT实验检测了重组质粒免疫的小鼠脾细胞内是否有单个CTL表位特异性能分泌IFN-γ的T细胞。如图5所示，重组表位免疫的小鼠体内有显著高水平的表位特异性T细胞（脾细胞体外肽刺激孔与无肽刺激孔比较差异有统计学意义，P＜0.05）。在重组质粒免疫的HLA-A*0201转基因小鼠脾细胞中NS4B78-86，NS5A367-375，C181-189，NS2172-180特异性分泌IFN-γ的T细胞的频率分别为56±7 IFN-γ SFCs/5×105脾细胞，86±9 IFN-γ SFCs/5×105脾细胞，45±7 IFN-γ SFCs/5×105脾细胞，62±7 IFN-γ SFCs/5×105脾细胞；在重组质粒免疫的HLA-A*1101转基因小鼠的脾细胞中NS3609-617，NS5B251-259特异性分泌IFN-γ的T细胞的频率分别为34±9 IFN-γ SFCs/5×105脾细胞和14±6 IFN-γ SFCs/5×105脾细胞；在重组质粒免疫的HLA-A*2402转基因小鼠脾细胞中NS5B382-390特异性分泌IFN-γ的T细胞的频率为43±4 IFN-γ SFCs/5×105脾细胞。

2.5 CTL杀伤结果 如图6所示，重组质粒免疫的小鼠的脾细胞可特异性杀伤负载单个CTL表位的脾细胞，其百分杀伤率与效应细胞和靶细胞的比率成正比。当效靶比为10∶1时，重组质粒免疫的小鼠的脾细胞对负载NS4B78-86、NS5A367-375、C181-189、NS2172-180、NS3609-617、NS5B251-259、NS5B382-390的脾细胞的百分杀伤率分别为（15.12±5.23）%、（22.63±7.76）%、（14.08±4.93）%、（20.95±6.75）%、（8.41±3.98）%、（6.28±3.21）%、（13.47±4.23）%。

3 讨论

目前，丙型肝炎的危害依然非常严重。因此，开发防治性疫苗仍是目前丙型肝炎的研究热点。考虑到CTL在防治丙型肝炎中发挥重要作用，基于高度保守的CTL表位的新型疫苗（尤其是DNA疫苗）非常具有吸引力。在前期的大量原创性研究中，我们从HCV中鉴定了7条高度保守的受HLA-A*0101、HLAA*1101、HLA-A*2402限制的CTL表位和2条Th表位。因此，基于上述表位的疫苗（尤其是CTL-Th表位嵌合DNA疫苗）具有潜在的应用价值。

图4 重组质粒的测序图

图5 重组质粒免疫HLA转基因小鼠诱导表位特异性T细胞反应

图6 重组质粒免疫HLA转基因小鼠诱导表位特异性CTL反应

大量研究已证实CTL-Th表位嵌合DNA疫苗可诱导更广泛的免疫反应，而且诱导的反应也强于全蛋白疫苗。但该类疫苗能否诱导免疫反应取决于多个因素：编码表位的基因能否启动表达，表达的串联表位能否进入内质网，串联表位能否被宿主的蛋白酶体裂解并释放出单个表位。目前对于此类疫苗的构建模式已形成共识，即该DNA疫苗中应携带Kozak序列，Ig κ链信号序列，编码广谱性Th表位（PADRE）的基因序列，编码单个表位的序列之间由编码连接桥的序列相连。因为Kozak序列能启动基因表达，并能增强多个CTL表位表达的准确性和效率[6]。Ig κ链信号序列则可介导编码的串联CTL表位进入内质网进而进行了内源性抗原的HLA-I类分子加工途径[7]。研究表明广谱性Th表位（PADRE表位）辅助特异性免疫反应的发生，PADRE可增强疫苗的免疫效应，其对于T细胞表位疫苗研发不可或缺，PADRE的免疫原性强于普通的T细胞表位[8]。多个CTL表位的排列直接影响单个CTL表位能否释放出来并诱导CTL反应，研究表明在CTL表位间引入连接桥不但有助于单个CTL表位的加工和释放，而且不会导致新的CTL表位的产生[6]。因此，为了更好设计HCV多表位DNA疫苗，我们充分考虑了我们鉴定的9个表位的排列顺序以实现：①蛋白酶体只在每个表位的羧基端裂解；②不产生新序列的肽段。并且我们采用两种蛋白酶体裂解软件预测肽的加工[9]以确保我们构建的DNA疫苗编码的串联表位能被小鼠蛋白酶体加工释放出单个表位。密码子优化有助于基因在选定宿主中高效表达，我们也相应地对所构建的串联表位基因进行了小鼠密码子优化。本研究中，我们尝试构建了能编码上述表位的CTL-Th表位嵌合DNA疫苗并采用HLA转基因小鼠探讨了其诱导免疫反应的能力。结果，我们发现本研究所构建的DNA疫苗免疫HLA转基因小鼠后可诱导单个CTL表位特异性的CTL反应。这说明此DNA疫苗可在小鼠组织内表达串联表位，后者可被小鼠蛋白酶体切割释放出单个的CTL表位进而诱导CTL反应。

近年来，国内外研究人员曾尝试构建了HCV的CTL表位串联DNA疫苗[10-12]，并证实了此类疫苗可诱导CTL反应。与他们的研究相比，我们的研究具有以下特点：①我们构建的CTL-Th表位嵌合DNA疫苗所编码的CTL表位具有广泛的人群覆盖率，其总的人群覆盖率可达到80%以上；②我们构建的疫苗编码的CTL表位在HCV中具有高度保守性；③我们构建的疫苗可诱导针对所能编码的所有单个CTL表位特异性的CTL反应。我们今后将进一步优化此DNA疫苗，使其能够编码更多的具有广泛人群覆盖率的CTL表位，并探讨此类疫苗的免疫保护效应。

[1]Dubuisson J, Cosset FL.Virology and cell biology of the hepatitis C virus life cycle-An update[J].J Hepatol, 2014, 61(1S): S3-S13.

[2]Heim MH, Thimme R.Innate and adaptive immune responses in HCV infections[J].J Hepatol, 2014, 61(1S): S14-S25.

[3]段志良, 张丽芳, 张琴, 等.丙型肝炎病毒CTL表位的HLAA2限制性及其免疫学效应研究[J].中华微生物学和免疫学杂志, 2009, 29(9): 822-826.

[4]陈俊, 段志良, 巩文词, 等.人白细胞抗原-A*0201限制性丙型肝炎病毒细胞毒性T淋巴细胞表位的鉴定[J].中华传染病杂志, 2010, 28(11): 651-655.

[5]钟晓芝, 段志良, 郭江龙, 等.丙型肝炎病毒HLA-A*1101 和A*2402限制性CD8+T细胞表位的研究[J].温州医科大学学报, 2014, 44(8): 547-554.

[6]Wei H, Lenz SD, Thompson DH, et al.DNA-vaccine platform development against H1N1 subtype of swine infuenza A viruses[J].Viral Immunol, 2012, 25(4): 297-305.

[7]Hayashi A, Wakita H, Yoshikawa T, et al.A strategy for efficient cross-presentation of CTL-epitope peptides leading to enhanced induction of in vivo tumor immunity[J].J Control Release, 2007, 117: 11-19.

[8]Polakova I, Duskova M, Smahel M.Antitumor DNA vaccination against the Sox2 transcription factor[J].Int J Oncol, 2014, 45(1): 139-146.

[9]Kesmir C, Nussbaum A, Schild H, et al.Prediction of proteasome cleavage motifs by neural network[J].Prot Eng, 2002, 15: 287-296.

[10] Memarnejadian A, Roohvand F, Arashkia A, et al.Polytope DNA vaccine development against hepatitis C virus: a streamlined approach from in silico design to in vitro and primary in vivo analyses in BALB/c mice[J].Protein Pept Lett, 2009, 16(7): 842-850.

[11] Memarnejadian A, Roohvand F.Fusion of HBsAg and prime/boosting augment Th1 and CTL responses to HCV polytope DNA vaccine[J].Cell Immunol, 2010, 261(2): 93-98.

[12] Shi L, Liu S, Fan GX, et al.Effective induction of type 1 cytotoxic T cell responses in mice with DNA vaccine encoding two hepatitis C viruscytotoxic T lymphocyte epitopes[J].Viral Immunol, 2006, 19(4): 702-711.

（本文编辑：吴健敏）

Construction of hepatitis C virus CTL-Th epitopes chimeric DNA vaccine

LI Dezhou1, DUAN Zhiliang2,GUO Jianglong2, WANG Sina2, LIU Huifang2, WANG Zhibin2, ZHONG Xiaozhi2, CHEN Yongping3, WEN Jinsheng2.1.Department of Liver, the Second Hospital of Ningbo, Ningbo, 315000; 2.Institute of Arboviruses, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 3.Department of Infection, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To construct hepatitis C virus (HCV) CTL-Th epitopes chimeric DNA vaccine and explore its in vivo immune response.Methods:Based on previously identified four HCV-specific HLAA*0201-restricted CTL (Cytotoxic T Lymphocyte) epitopes (NS4b_78, NS5a_367, C_181 and NS2_172), two HLA-A*1101-restricted CTL epitopes (NS3_609 and NS5b_251), one HLA-A*2402-restricted CTL epitopes (NS5b_382) and two Th epitopes (P73-15and NS5A276-288), the gene encoding chimeric CTL epitopes and Th epitopes was synthesized and cloned into eukaryotic expressing vector pcDNATM3.1/myc-His(-) A.The recombinant plasmid was used to immunize HLA-A*0201, HLA-A*1101 and HLA-A*2402 transgenic mice, ELISPOT and CTL cytotoxicity assay were used to measure the frequencies of CTL epitope-specifc T cells in splenocytes of mice and the cytotoxic activity of CTL against target cells.Results: The gene containing Kozak sequence and encoding Igκ chain signal sequence, seven CTL epitopes, two Th epitopes was successfully cloned into eukaryotic expressing vector.Recombinant plasmid immunization elicited epitope-specifc IFN-γ-secreting T cells which could lyse CTL epitope-pulsed splenocytes.Conclusion:A Hepatitis C virus CTL-Th epitopes chimeric DNA vaccine which can induce epitope-specifc CTL response is successfully constructed.

hepatitis C virus; cytotoxicity T lymphocyte; epitope; DNA vaccine; mice

R373.2

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.02.001

2014-10-11

国家自然科学基金资助项目（31070143）；浙江省自然科学基金资助项目（LY13H160035）；浙江省科技计划项目（2014C33261）；宁波市科技计划项目（2012A610247）。

李德周（1980-），男，浙江瑞安人，主治医师，硕士。

文金生，副教授，硕士生导师，Email：wjs78@wmu.edu.cn。