脑5-羟色胺及其旁路关键酶在术后疲劳综合征大鼠模型中的变化

裘益辉，虞冠锋，叶星照，董千铜，吴天添，邵时杰，余震

（1.温州医科大学附属第一医院 血管外科，浙江 温州 325015；2.温州医科大学附属第一医院 肛肠外科，浙江 温州 325015；3.温州医科大学附属第一医院 胃肠外科，浙江 温州 325015；4.同济大学附属第十人民医院 普外科，上海 200072）

·论 著·

脑5-羟色胺及其旁路关键酶在术后疲劳综合征大鼠模型中的变化

裘益辉1，虞冠锋1，叶星照2，董千铜3，吴天添3，邵时杰3，余震4

（1.温州医科大学附属第一医院 血管外科，浙江 温州 325015；2.温州医科大学附属第一医院 肛肠外科，浙江 温州 325015；3.温州医科大学附属第一医院 胃肠外科，浙江 温州 325015；4.同济大学附属第十人民医院 普外科，上海 200072）

目的：探讨脑5-羟色胺（5-HT）及其旁路关键酶在术后疲劳综合征（POFS）大鼠模型中的变化。方法：将64只SD实验大鼠随机分为模型组和对照组（各分为术后1、3、7、10 d组），模型组行70%中段小肠切除端端吻合术，对照组仅行开关腹手术。分别于术后1、3、7、10 d取脑组织，采用高效液相色谱-串联质谱法测定海马组织中5-HT的含量，荧光定量PCR法检测海马组织中色氨酸羟化酶1、2（TPH1、TPH2）和吲哚胺-2，3-二加氧酶（IDO）的表达量。结果：与对照组相比，模型组大鼠5-HT的含量分别于术后1、3 d明显升高（P＜0.05）；在模型组大鼠中，术后1、3 d 5-HT的含量均较术后7、10 d明显升高（P＜0.05），术后3 d升至最高（P＜0.05），术后7、10 d逐渐恢复正常。与对照组相比，模型组大鼠TPH1的表达量于术后3 d明显升高（P＜0.05）；在模型组大鼠中，术后3 d TPH1的表达量较术后1、7、10 d明显升高（P＜0.05）。与对照组相比，模型组大鼠TPH2的表达量分别于术后1、3 d明显升高（P＜0.05）；在模型组大鼠中，术后1、3 d TPH2的表达量均较术后7、10 d明显升高（P＜0.05），术后3 d升至最高，术后7、10 d逐渐恢复正常。与对照组相比，模型组IDO的表达量于术后1 d明显升高（P＜0.05）；在模型组大鼠中，术后1 d IDO的表达量较术后3、7、10 d明显升高（P＜0.05）。结论：在POFS大鼠模型中，5-HT的含量术后早期明显升高，其升高与5-HT限速酶TPH1、TPH2的表达量上调密切相关。

术后疲劳综合征；5-羟色胺；色氨酸羟化酶；吲哚胺-2，3-二加氧酶；大鼠

1 材料和方法

1.1 实验动物 SPF级SD成年大鼠64只，雄性，体质量220～250 g，由中国科学院上海实验动物中心提供。实验用动物均单独饲养于清洁的饲养笼内，可以自由摄食和饮水，饲养室的温度保持在20～22 ℃，湿度维持在55%左右，每日明暗时间比为12 h/ 12 h。

1.2 实验试剂及仪器设备 甲酸、乙腈购于成都金山化学试剂有限公司；TRIZOL购于美国Invitrogen公司；无水甲醇、异丙醇、氯仿购于天津市四友生物医学技术有限公司；反转录试剂盒、PCR扩增kit购于上海博仕生物医学服务中心；胶回收kit购于德国MN公司。Agilent1200高效液相色谱仪购自美国Agilent公司；API4000液质联用仪购自美国AB公司；Chromolith RP-18 endcapped色谱柱购自德国Merck公司；组织匀浆器购自美国Pro Scientific公司；电泳仪购自美国BIO-RAD公司；Nanodrop 1000微量分光光度计购自美国Thermo公司；UVP凝胶成像系统购自美国UVP公司；SLAN-96P实时荧光定量PCR仪购自上海宏石医疗科技有限公司。

1.3 动物分组和模型制作 本实验以SD大鼠为实验动物，按体质量大小编号后随机分为模型组（n= 32）和对照组（n=32），各分为术后1 d组（n=8）、术后3 d组（n=8）、术后7 d组（n=8）和术后10 d组（n= 8）。大鼠在2%戊巴比妥钠按30 mg/kg腹部皮下注射麻醉后，模型组行70%中段小肠切除端端吻合术建立POFS大鼠模型[3]，对照组仅行开关腹手术。2组大鼠术前术后各禁食24 h，不禁水，术后24 h开始自由摄食和饮水。

1.4 脑海马组织的采集检测 2组大鼠分别于术后1、3、7、10 d用2%戊巴比妥钠麻醉后，迅速断头，在冰面上取出大脑海马组织，用冰冷的0.9%氯化钠溶液冲洗除去血液，滤纸拭干称质量，置于液氮固化存放后-80 ℃储存待测。采用高效液相色谱-串联质谱法测定脑海马组织5-HT的含量。色谱条件：流动相A为水，流动相B为乙腈；质谱条件：碰撞气（CAD）为4 L/min，气帘气（CUR）为25 L/min，雾化气（GS1）为30 L/min，辅助气（GS2）为40 L/min，喷雾电压（IS）为5 500 V，去溶剂温度（TEMP）为500 ℃。采用荧光定量PCR法检测海马组织中色氨酸羟化酶（tryptophan hydroxylase，TPH）1、2和吲哚胺-2，3-二加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）的表达量。内参照18S引物序列：p5为agtcgccgtgc ctaccat，p3为cgggtcgggagtgggtaat；TPH1引物序列：p5为gtgccggcctgctttcttcc，p3为gcgctggttat gctcttgctgtct；TPH2引物序列：p5为catggctccga ccccctctaca，p3为tacgcccgcagttgaccttcttg；IDO引物序列：p5为ggctgcctcccattctgtctta，p3为gc tttcgggtcttgatgctctact。

1.5 统计学处理方法 采用统计软件SPSS17.0进行分析。数据用±s表示。模型组与对照组的比较采用独立样本t检验；实验组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

表3 2组大鼠脑海马组织TPH2表达量（n=8，±s）

表3 2组大鼠脑海马组织TPH2表达量（n=8，±s）

与对照组比：aP＜0.05

2 结果

2.1 2组大鼠的一般情况 与对照组相比，模型组大鼠术后体质量增长缓慢，眯眼，毛发无光泽，自我清洁能力差，随着术后时间的延长逐渐好转。

2.2 脑海马组织5-HT的含量 如表1，与对照组相比，模型组大鼠5-HT的含量分别于术后1、3 d明显升高（P＜0.05），术后7、10 d无明显差异。在模型组大鼠中，术后1、3 d 5-HT的含量均较术后7、10 d明显升高（P＜0.05），术后3 d升至最高（P＜0.05），术后7、10 d逐渐恢复正常。对照组大鼠，术后1、3、7、10 d间5-HT的含量差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5 脑海马组织IDO的表达量 如表4，与对照组相比，模型组大鼠IDO的表达量于术后1 d明显升高（P＜0.05），术后3、7、10 d无明显差异。在模型组大鼠中，术后1 d IDO的表达量较术后3、7、10 d明显升高（P＜0.05），术后3、7、10 d间比较无明显差异。在对照组大鼠中，术后1、3、7、10 d间IDO的表达量差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表4 2组大鼠脑海马组织IDO的表达量（n=8，±s）

表4 2组大鼠脑海马组织IDO的表达量（n=8，±s）

与对照组比：aP＜0.05

表1 2组大鼠脑海马组织5-HT的含量（n=8，±s）

表1 2组大鼠脑海马组织5-HT的含量（n=8，±s）

与对照组比：aP＜0.05

2.3 脑海马组织TPH1的表达量 如表2，与对照组相比，模型组大鼠TPH1的表达量于术后3 d明显升高（P＜0.05），术后1、7、10 d无明显变化。在模型组大鼠中，术后3 d TPH1的表达量较术后1、7、10 d明显升高（P＜0.05），术后1、7、10 d间无明显差异。在对照组大鼠中，术后1、3、7、10 d间TPH1的表达量差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表2 2组大鼠脑海马组织TPH1的表达量（n=8，±s）

表2 2组大鼠脑海马组织TPH1的表达量（n=8，±s）

与对照组比：aP＜0.05

2.4 脑海马组织TPH2的表达量 如表3，与对照组相比，模型组大鼠TPH2的表达量分别于术后1、3 d明显升高（P＜0.05），术后7、10 d无明显差异。在模型组大鼠中，术后1、3 d TPH2的表达量均较术后7、10 d明显升高（P＜0.05），术后3 d升至最高，术后7、10 d恢复正常。在对照组大鼠中，术后1、3、7、10 d间TPH2的表达量差异均无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

腹部大手术创伤引起机体一系列复杂的应激反应，主要表现为内分泌代谢的改变、炎症反应和免疫抑制，容易导致术后各种并发症[5-6]，其中POFS就是最常见的并发症之一。而POFS作为集生理、心理和社会因素为一体的复杂并发症，在术后相当长的一段时间里都严重影响患者术后的恢复[7]。虽然国内外学者建立了一系列评估方法并采用多模式干预POFS的发展且取得一定疗效[8-9]，但其病因及发生机制尚不明确。POFS的病因是多源性的，主要与患者的心血管功能、营养状况、骨骼肌系统变化、生化标记物、手术类型及心理因素有关，可以概括为手术创伤、营养状况、身体适应性、细胞因子及心理学理论[1]。在本研究前期建立的POFS大鼠模型中，大鼠腹部大手术后恢复期三个脑区5-HT的含量呈现波动性变化[4]。5-HT又名血清素，人体95%的5-HT存在于胃肠道，5%在中枢神经系统中，因血脑屏障的存在，血液中的5-HT很难进入中枢神经系统，因此中枢5-HT和外周5-HT分属两个独立的系统。而中枢5-HT具有广泛的功能，参与心血管活动、觉醒-睡眠周期、痛觉、精神情感活动和下丘脑-垂体的神经内分泌活动的调节[10]。本实验结果显示，模型组大鼠中枢5-HT的含量于术后1、3 d明显升高，术后3 d升至最高，术后7、10 d逐渐恢复正常。这进一步表明5-HT的含量术后早期明显升高与POFS的发生发展有着重要的联系。

脑内5-HT神经元主要在末梢合成5-HT：色氨酸（Trp）在色氨酸羟化酶（TPH）的催化下生成5-羟色氨酸（5-HTP），再经脱羧酶的作用成为5-HT。TPH作为5-HT合成的限速酶，一般认为存在两种分子学类型，即TPH1和TPH2两个亚型，脑海马组织中两种亚型都有表达，水平基本相当[11-12]。TPH的活性直接决定5-HT含量的变化，因而TPH调控影响的研究比5-HT本身含量的研究更有价值[11]。本实验结果显示模型组大鼠TPH1的表达量术后3 d明显升高，TPH2的表达量术后1、3 d明显升高，术后3 d升至最高，术后7、10 d逐渐恢复正常。结合5-HT结果，我们推测5-HT的含量术后3 d升高可能是TPH1 和TPH2共同作用的结果，而5-HT术后1 d升高可能TPH2起着更大的作用。在本实验中，无论模型组还是对照组，TPH2的表达量明显高于TPH1的表达量，关于TPH亚型在海马中的表达量值得下一步研究。

5-HT的前体物质Trp除了经TPH途径生成5-HT外，还可经IDO分解形成犬尿氨酸（5-HT旁路）。IDO广泛分布于除肝脏以外的组织，主要存在于巨噬细胞及脑内皮细胞、血管周巨噬细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞，而IDO的活性主要由IL-1β、TNF-α、IFN-γ等促炎细胞因子激活[13]。一方面，IDO活性的改变直接决定5-HT的前体物质Trp的含量进而影响中枢5-HT合成的含量；另一方面，IDO可以将5-HT的前体物质Trp分解成犬尿氨酸，而犬尿氨酸进一步分解为喹啉酸和犬尿酸，前者是强力的N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体激动剂，过度刺激NMDA受体可导致神经元性损害，后者是NMDA受体谷氨酸识别部位的拮抗剂，可以减少NMDA受体的过度刺激[14]。所以促炎细胞因子诱导的IDO活性改变可以影响两者的比率进而打破这种神经损害保护平衡。因此5-HT旁路可以通过中枢促炎细胞因子的激活，引起下游的NMDA受体的过度刺激致神经退化，最终可能引起POFS。本实验结果显示，模型组大鼠IDO的表达量术后1 d明显升高，这就意味着5-HT的前体物质Trp减少，而5-HT的含量术后1 d明显升高，这可能与5-HT的合成底物Trp进入脑内足够多有关；模型组大鼠IDO的表达量术后3 d明显回落，这可能与促炎细胞因子回落或者TPH的高表达调控有关。IDO的表达量术后明显升高进而影响5-HT旁路及下游NMDA受体的表达可能是POFS发生发展的重要机制之一。综上所述，5-HT在POFS中的作用得到进一步证实，其主要受到其限速酶TPH的调控。因手术创伤部位的促炎细胞因子既可以在外周发挥作用，又可以进入中枢发挥效应，其中IL-1β、TNF-α发挥着重要作用[15]，所以手术应激引起外周促炎细胞因子的升高，进入中枢神经系统诱导IDO活性改变，进而激活5-HT旁路及其下游产物可能是POFS的发生机制之一。

[1]Zargar-Shoshtari K, Hill AG.Postoperative fatigue: a review [J].World J Surg, 2009, 33(4): 738-745.

[2]Jensen MB, Houborg KB, Norager CB, et al.Postoperative changes in fatigue, physical function and body composition: an analysis of the amalgamated data from five randomized trials on patients undergoing colorectal surgery[J].Colorectal Dis, 2011, 13(5): 588-593.

[3]Zhang XD, Chen BC, Dong QT, et al.Establishment and assessments of a new model for the postoperative fatigue syndrome by major small intestinal resection in rats[J].Scand J Gastroenterol, 2011, 46(11): 1302-1309.

[4]董千铜, 周锋, 余震, 等.腹部手术后中枢单胺类神经递质和外周血游离氨基酸的变化与术后疲劳的关系[J].中华胃肠外科杂志, 2011, 14(12): 968-972.

[5]Sido B, Teklote JR, Hartel M, et al.Infammatory response after abdominal surgery[J].Best Pract Res Clin Anaesthesiol, 2004, 18(3): 439-454.

[6]Zargar-Shoshtari K, Paddison JS, Booth RJ, et al.A prospective study on the infuence of a fast-track program on postoperative fatigue and functional recovery after major colonic surgery[J].J Surg Res, 2009, 154(2): 330-335.

[7]Barnason S, Zimmerman L, Nieveen J, et al.Relationships between fatigue and early postoperative recovery outcomes over time in elderly patients undergoing coronary artery bypass graft surgery[J].Heart Lung, 2008, 37(4): 245-256.

[8]Agarwal KA, Tripathi CD, Agarwal BB, et al.Efficacy of turmeric (curcumin) in pain and postoperative fatigue after laparoscopic cholecystectomy: a double-blind, randomized placebo-controlled study[J].Surg Endosc, 2011, 25(12): 3805-3810.

[9]Tan S, Zhou F, Li N, et al.Anti-fatigue effect of ginsenoside Rb1 on postoperative fatigue syndrome induced by major small intestinal resection in rat[J].Biol Pharm Bull, 2013, 36(10): 1634-1639.

[10] Struder HK, Weicker H.Physiology and pathophysiology of the serotonergic system and its implications on mental and physical performance.Part II[J].Int J Sports Med, 2001, 22(7): 482-497.

[9]张霞, 李晓梅, 姜松芬, 等.TACE与TAPVE鸦胆子油栓塞化疗治疗晚期肝癌的临床观察[J].中国伤残医学, 2010, 18(1): 23-25.

[10] 冯怡, 邓远辉, 陈桂容, 等.鸦胆子抗人乳头瘤病毒的作用研究[J].中成药, 2006, 28(12): 1819-1820.

[11] de Boer MA, Jordanova ES, Kenter GG, et al.High human papillomavirus oncogene mRNA expression and not viral DNA load is associated with poor prognosis in cervical cancer patients [J].Clin Cancer Res, 2007, 13(1): 132-138.

[12] 王萍, 崔竹梅, 罗兵, 等.小分子干扰RNA对子宫颈癌细胞中人乳头状瘤病毒18型E6、E7mRNA表达的影响[J].中华妇产科杂志, 2006, 41(3): 190-193.

[13] 牛晓宇, 彭芝兰, 王和.RNA干涉抑制宫颈癌CaSki细胞株HPV16 E6基因的研究[J].癌症, 2004, 23(11): 1257-1262.

[14] Chang JT, Kuo TF, Chen YJ, et al.Highly potent and specific siRNAs against E6 or E7 genes of HPV16-or HPV18-infected cervical cancers[J].Cancer Gene Ther, 2010, 17 (12): 827-836.

[15] 尹香菊, 栾和芝, 安春丽, 等.鸦胆子油乳对宫颈癌Hela细胞的抑制作用及其作用机制[J].中国肿瘤生物治疗杂志, 2008, 15(4): 393-395.

[16] Munger K, Baldwin A, Edwards KM, et al.Mechanisms of human papillomavirus induced oncogenesis[J].J Virol, 2004, 78(21): 11451-11460.

（本文编辑：胡苗苗）

[11] Xu CX, Liu HT, Wang J.Changes of 5-hydroxytryptamine and tryptophan hydroxylase expression in the ventral horn of spinal cord[J].Neurosci Bull, 2008, 24(1): 29-33.

[12] Walther DJ, Peter JU, Bashammakh S, et al.Synthesis of serotonin by a second tryptophan hydroxylase isoform[J].Science, 2003, 299(5603): 76.

[13] Muller N, Schwarz MJ.The immune-mediated alteration of serotonin and glutamate: towards an integrated view of depression[J].Mol Psychiatry, 2007, 12(11): 988-1000.

[14] Wichers MC, Koek GH, Robaeys G, et al.IDO and interferon-alpha-induced depressive symptoms: a shift in hypothesis from tryptophan depletion to neurotoxicity[J].Mol Psychiatry, 2005, 10(6): 538-544.

[15] Dantzer R.Cytokine, sickness behavior, and depression[J].Immunol Allergy Clin North Am, 2009, 29(2): 247-264.

（本文编辑：丁敏娇）

The role of changes of key enzymes of brain 5-hydroxytryptamine and 5-hydroxytryptamine bypass in ratmodel of postoperative fatigue syndrome

QIU Yihui1, YU Guanfeng1, YE Xingzhao2, DONG Qiantong3, WU Tiantian3, SHAO Shijie3, YU Zhen4.1.Department of Vascular Surgery, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Whenzhou, 325015; 2.Department of Anorectal Surgery, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Whenzhou, 325015; 3.Department of Gastrointestinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Whenzhou, 325015; 4.Department of General Surgery, Tenth People’s Hospital Affiliated to Tongji University, Shanghai, 200072

Objective:To explore the role of changes of key enzymes of brain 5-HT and 5-HT bypass in rat model of postoperative fatigue syndrome.Methods:64 SD rats were randomly divided into model group and control group according to the weigh (which both including 1 d, 3 d, 7 d, 10 d group).The rats of model group would be resected the middle 70% small bowel, and control group only undergoing on-off abdominal surgery.The brains were removed on 1 d, 3 d, 7 d, 10 d postoperatively respectively, and we detected the concentration of 5-HT by high performance liquid chromatography and the mRNA expression of TPH1, TPH2, IDO by realtime fuorescence quantitative PCR in hippocampus area.Results: Compared with control group, concentration of 5-HT of model group rats increased signifcantly on 1 d, 3 d postoperatively respectively (P＜0.05).And in model group rats, concentration of 5-HT on 1 d, 3 d increased signifcantly respectively compared with 7 d, 10 d postoperatively (P＜0.05), on 3 d to its highest (P＜0.05), 7 d, 10 d gradually returned to normal.Compared with control group, mRNA expression of TPH1 in model group rats increased signifcantly on 3 d postoperatively (P＜0.05).And inmodel group rats, mRNA expression of TPH1 on 3 d increased signifcantly compared with 1 d, 7 d, 10 d postoperatively (P＜0.05).Compared with control group, mRNA expression of TPH2 in model group rats increased signifcantly on 1 d, 3 d postoperatively respectively (P＜0.05).And in model group rats, mRNA expression of TPH2 on 1 d, 3 d increased signifcantly respectively compared with 7 d, 10 d postoperatively (P＜0.05), on 3 d to its highest, 7 d, 10 d gradually returned to normal.Compared with control group, mRNA expression of IDO in model group rats increased signifcantly on 1d postoperatively (P＜0.05).And in model group rats, mRNA expression of IDO on 1 d increased signifcantly compared with 3 d, 7 d, 10 d postoperatively (P＜0.05).Conclusion:In rat model of postoperative fatigue syndrome, concentration of 5-HT increases signifcantly early postoperatively.Its mechanism refers to up-regulation of mRNA expression of TPH1, TPH2 of 5-HT rate-limiting enzyme.

postoperative fatigue syndrome; 5-hydroxytryptamine; tryptophan hydroxylase; indoleamine 2, 3-dioxygenase; rats术后疲劳综合征（postoperative fatigue syndrome，POFS）是外科术后恢复期普遍和主要的并发症之一，其主要特征表现为肌肉无力，睡眠时间增加，集中注意力能力下降，以及一定程度的抑郁，尤其以腹部大手术后1个月内最为显著[1-2]。作为一组延缓术后患者恢复至正常活动的生理和心理症状的统称，它不仅减弱患者的劳动能力，降低患者的生活质量，而且延长康复时间，增加医疗护理费用。近年来，中枢神经递质5-羟色胺（5-HT）因可能涉及POFS的发病机制而受到关注。在本研究前期建立的POFS大鼠模型中[3]，我们发现中枢神经系统5-HT水平的波动可能与腹部大手术POFS的发生发展有着重要的联系[4]。本实验以此为切入点，研究脑5-HT及其旁路关键酶的变化，探讨其在POFS大鼠模型中的作用机制，为寻找有效的靶点干预POFS提供理论依据。

R33

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.02.002

2014-07-10

国家自然科学基金资助项目（81171857）；浙江省卫生厅支撑学科资助项目（11-ZC24）。

裘益辉（1988-），男，浙江温州人，住院医师，硕士。

余震，教授，博士生导师，Email：yuzhen0577@163.com。