潘镏镏,郑飞云,诸海燕,章圣辉,胡燕
(1.温州医科大学附属第二医院 妇科,浙江 温州 325027;2.温州医科大学附属第一医院 妇科,浙江温州 325015)
·论 著·
鸦胆子素D对HPV16感染细胞株的作用及其可能机制
潘镏镏1,郑飞云2,诸海燕2,章圣辉2,胡燕2
(1.温州医科大学附属第二医院 妇科,浙江 温州 325027;2.温州医科大学附属第一医院 妇科,浙江温州 325015)
目的:研究鸦胆子素D对高危型人类乳头瘤病毒(HPV)16感染细胞的增殖抑制作用、促凋亡作用及其可能机制。方法:以人宫颈鳞状上皮永生化细胞株(Ect1/E6E7)作为HPV16型感染的宫颈癌前病变的体外实验模型,用1、5、10、15、30 μ mol/L的鸦胆子素D分别体外作用于细胞24、48、72 h,用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法测定细胞增殖活性改变;以1、5、10 μ mol/L的鸦胆子素D分别体外作用于细胞24、48、72 h后,Cell cycle staining solution检测细胞生长周期变化,Hoechst 33258细胞核荧光染色法观察细胞凋亡情况,Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率。宫颈癌细胞株Caski含有完整的HPV16型E6、E7基因序列,以此作为阳性对照,通过实时荧光定量PCR技术检测两种细胞内HPV16 E6、E7基因mRNA的表达。结果:鸦胆子素D对Ect1/E6E7细胞具有明显的抑制体外增殖作用,MTT结果显示抑制作用呈时间和浓度依赖性(P<0.05)。经1、5、10 μ mol/L鸦胆子素D体外作用48 h后,细胞生长周期停滞于G1期。流式细胞仪检测显示,各实验组细胞经鸦胆子素D作用48 h后,细胞凋亡率分别为(6.25± 0.76)%、(20.21±1.32)%和(8.61±1.59)%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。Hochest33258细胞核染色法显示细胞出现凋亡形态学改变。Real-time PCR技术检测结果显示Ect1/E6E7中HPV16 E6、E7 mRNA表达水平无明显下降,与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。而Caski中HPV16 E6、E7 mRNA表达水平下降,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:鸦胆子素D能有效地抑制Ect1/E6E7细胞增殖,其机制可能是通过抑制HPV16 E6、E7 mRNA表达从而促进细胞凋亡。
人宫颈永生化细胞;鸦胆子素D;增殖;人乳头瘤病毒16
宫颈癌是女性最常见恶性肿瘤之一,目前认为高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的持续性感染是导致宫颈癌发生的必要条件。HPV病毒DNA通常可以整合到宿主细胞DNA中编码并表达E6、E7蛋白,在细胞癌变过程中起重要作用。鸦胆子素D(Bruceine D)是中药鸦胆子中提取出的具有水溶性的三环四萜类化合物,是鸦胆子的主要成分。我们前期工作已证实了鸦胆子油乳对宫颈癌前细胞和癌细胞具有抑制增殖、促凋亡作用[1-2]。本研究以鸦胆子素D为研究对象,以期明确鸦胆子素D对高危型HPV16感染细胞的作用及其可能的抗病毒作用的机制。
1.1 材料
1.1.1 细胞株:人宫颈永生化鳞状细胞株(Ect1/ E6E7)购自上海拜力生物科技有限公司(美国模式培养物集存库编号为CRL-2614),人宫颈癌细胞株Caski购自中国科学院上海细胞库(美国模式培养物集存库编号为CRM-CRL-1550)。
1.1.2 主要试剂:鸦胆子素D粉剂(20 mg/支,纯度:高效液相色谱法≥98%,上海源叶生物科技有限公司),RPMI-1640培养液、胎牛血清(美国GIBCO公司),3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)(美国Sigma公司),Annexin V-AF488/PI凋亡试剂盒、Cell cycle staining solution(CCS01)试剂盒(美国Invitrogen公司),Hoechst33258试剂(碧云天生物技术研究所),反转录试剂盒(美国Fermentas公司),Real-time PCR试剂盒(美国Bio-rad公司)。
1.1.3 主要设备:Hetus恒温水浴箱、Beckman离心机、Olympas相差倒置显微镜、Forma二氧化碳培养箱、流式细胞仪(FACS Calibur)、ELX800酶联免疫检测仪、Olympus荧光显微镜(CX41)、ABI7500实时荧光定量PCR仪。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养和药物配置:Ect1/E6E7、Caski细胞株在含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 μ g/mL的RPMI-1640培养基中,在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。取对数生长期的细胞用于实验研究。鸦胆子素D粉剂加入二甲基亚砜(DMSO)溶液中溶解后,加入RPMI-1640培养基中,配制成10 mmol/L的鸦胆子素D溶液,-4 ℃避光保存,DMSO在溶液中的含量<0.05%。
1.2.2 MTT法检测细胞体外增殖活性:取对数生长期的细胞,以1×104个细胞/孔接种于96孔板培养,每组设5个复孔。以终浓度为1、5、10、15、30 μ mol/L的鸦胆子素D作用Ect1/E6E7细胞作为实验组,对照组不加药物,作用24、48、72 h后,分别取出培养板,加入MTT 20 μ L,培养箱内孵育4 h,弃上清,每孔加入150 μ L DMSO,置摇床上低速振荡30 min,用ELX800酶联免疫检测仪在490 nm测定吸光度值,计算细胞生长抑制率(cell growth inhibition rate,CGIR)=1-A(实验组-空白组)/A(对照组-空白组)。实验重复3次。
1.2.3 Cell cycle staining solution检测细胞周期:实验组Ect1/E6E7细胞用1、5、10 μ mol/L的鸦胆子素D作用,对照组不加药,48 h后收集,PBS 洗2次,加入1 mL CCS01 Cell cycle staining buffer,避光孵育半小时后上流式细胞仪检测,经Modifit软件分析,实验重复3次。
1.2.4 Annexin V-AF488/PI法检测细胞凋亡率:按5×104个/mL密度将Ect1/E6E7细胞接种于6孔板中培养,设对照组和终浓度为1、5、10 μmol/L的实验组,作用48 h后收集细胞,按试剂盒程序常规染色,1 h内上流式细胞仪检测。检测结果经Cell Quest软件分析,实验重复3次。
1.2.5 Hoechst33258细胞核染色法检测细胞凋亡形态学改变:按1×104个/mL密度将Ect1/E6E7细胞接种于6孔板中,6孔板内预先放入由多聚赖氨酸处理过的无菌盖玻片(18 mm×18 mm)进行细胞爬片。将5 μ mol/L的鸦胆子素D作用Ect1/E6E7细胞设为实验组,对照组Ect1/E6E7细胞仅加入培养液,作用48 h后,按试剂盒程序常规染色,置荧光显微镜下观察细胞凋亡形态学变化。
1.2.6 Real-time PCR法检测细胞E6、E7 mRNA表达:分别收集经1、5、10 μmol/L鸦胆子素D作用48 h后的Ect1/E6E7、Caski和对照组细胞,TRIzol法提取总RNA,在1.5%琼脂糖凝胶上电泳,在紫外灯下观察出现清晰集中的28S、18S、5S三条带,且28S/18S约为2∶1,证实RNA制品完整,未被降解。紫外分光光度计测定RNA浓度,调整RNA浓度为2 μ g/L。将RNA反转录为cDNA。模板为:RNA 1 μ L,5×Buffer 4 μL,10 mol/L dNTP 2 μL,Rnase Inhibitor 1 μ L,Reverse Transcriptase 1 μ L,Random Primer 1 μ L,Water 10 μ L,反应体系25 ℃ 5 min,42 ℃60 min,70 ℃ 5 min,一个循环,产物置于-20 ℃保存。HPV16 E6引物序列(159 bp):上游5’-GAACA GCAATACAACAAACCG-3’,下游5’-TCTGCAACAAGACATA CATCG-3’。HPV16 E7引物序列(245 bp):上游5’-AT GGAGATACACCTACATTGC-3’,下游5’-TAACAGGTCTTCC AAAGTACG-3’。内参GAPDH引物序列(251 bp):上游5’-CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3’,下游5’-GCCA GTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3’。引物均委托Invitrogen公司合成。Real-time PCR模板:2×mix 12.5 μ L,上下游引物各0.5 μ L,cDNA 5 μ L,加水至25 μL。扩增条件:94 ℃预变性2 min,94 ℃变性30 s,51 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,共40个循环;72 ℃延伸5 min。设GAPDH内参基因组、Caski阳性对照组、目的基因组以及2管空白对照组(由DEPC水代替cDNA)。每个样本设3个复孔,实验重复3次。
1.3 统计学处理方法 采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。计量资料用±s表示,所有数据进行正态性及方差齐性检验,方差齐性者多组样本均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),两两比较采用LSD法,方差不齐者进行Kruskal-Wallis检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 鸦胆子素D对Ect1/E6E7细胞体外增殖活性的影响 MTT法检测结果(见表1)显示,在不同浓度鸦胆子素D体外作用下,实验组细胞生长抑制率与同时间点对照组比较均明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。且随作用时间逐渐延长,与同浓度组比较均明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。可见,鸦胆子素D对Ect1/E6E7细胞生长具有抑制作用,并呈浓度和时间依赖性。
表1 不同浓度鸦胆子素D对Ect1/E6E7细胞体外增殖活性的影响(±s)
表1 不同浓度鸦胆子素D对Ect1/E6E7细胞体外增殖活性的影响(±s)
与同一时间对照组比:aP<0.05;与同一浓度作用24 h比:bP<0.05
2.2 鸦胆子素D对Ect1/E6E7细胞周期及细胞凋亡的影响 经鸦胆子素D作用48 h后,Ect1/E6E7细胞G0/G1期比率上升,S期和G2/M期细胞比率下降,实验组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),表明细胞周期被阻滞于G0/G1期(见表2);Annexin V-AF488/PI法检测细胞凋亡,将晚期凋亡细胞、坏死细胞(右上象限)及早期凋亡细胞(右下象限)合计为总体凋亡率(见表2、图1),细胞凋亡率逐渐升高,实验组与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),其中5 μ mol/L时凋亡率达峰值。实验组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。
2.3 Hochest33258细胞核染色法检测结果 对照组细胞核呈圆形或椭圆形,荧光微弱、呈弥散性,而经5 μ mol/L的鸦胆子素D体外作用48 h后,细胞核致密、浓染,或呈碎块状的蓝色荧光,如图2中箭头提示有染色质固缩的凋亡细胞核改变,形成凋亡小体。
表2 鸦胆子素D体外作用48 h对Ect1/E6E7细胞周期及凋亡的影响(±s,%)
表2 鸦胆子素D体外作用48 h对Ect1/E6E7细胞周期及凋亡的影响(±s,%)
与对照组比:aP<0.05
图1 不同浓度鸦胆子素D体外作用48 h对Ect1/E6E7细胞凋亡率的影响
图2 5 μmol/L鸦胆子素D体外作用Ect1/E6E7 48 h后细胞凋亡变化
2.4 鸦胆子素D体外作用对HPV16 E6、E7基因的mRNA表达影响 Real-time PCR法测定每组样本中每一个基因的△Ct,然后计算出2-△△Ct(见表3)。经1、5、10 μmol/L鸦胆子素D体外作用48 h后,随药物浓度增加,Ect1/E6E7细胞中HPV16 E6、E7 mRNA的2-△△Ct无明显增加趋势,即药物浓度的增加并不能抑制mRNA表达,实验组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。而Caski细胞中HPV16 E6、E7 mRNA的2-△△Ct随药物浓度增加而增加,实验组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),即mRNA表达水平与鸦胆子素D的作用具有浓度依赖性,呈递减趋势。
表3 Real-time PCR技术测定不同浓度鸦胆子素D作用后E6、E7 mRNA的2-△△Ct(±s)
表3 Real-time PCR技术测定不同浓度鸦胆子素D作用后E6、E7 mRNA的2-△△Ct(±s)
与对照组比:aP<0.05
在之前的研究中,我们已经证明了鸦胆子油乳对高危型HPV16感染细胞Ect1/E6E7、Caski具有抑制增殖作用[1-2],并且具有下调HPV病毒癌基因E6、 E7 mRNA表达水平的作用。而国内也有大量研究显示鸦胆子油乳对肺癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌等具有抗肿瘤细胞增殖和促进凋亡的作用,可能是通过抑制DNA的合成,或直接破坏肿瘤细胞生物膜结构,或增加对抗癌药物的通透性,诱导细胞凋亡作用等方式[3-9]。对于鸦胆子油乳在抗HPV治疗中的相关研究,有国内学者报道鸦胆子油对离体尖锐湿疣组织中HPV DNA有明显的破坏作用,抑制病毒的正常复制扩增。其机制可能与改变细胞膜通透性有关,细胞膜通透性增大使得药物在细胞内浓度增加,从而产生杀灭或抑制病毒的效果,或直接抑制病毒DNA的合成[10]。
生殖道高危型HPV的持续性感染已被证实为宫颈癌的主要危险因素之一。目前认为,HPV16、HPV18、HPV31、HPV33等高危险型HPV,易造成宫颈癌。HPV中的E6、E7基因及其产物E6、E7蛋白具有导致正常细胞癌变的作用[11-12]。国内外许多学者研究[13-16]发现siRNA能通过抑制E6、E7 mRNA表达,使E6、E7蛋白表达减少,p53或pRb堆积,引起肿瘤细胞凋亡,提示E6、E7可作为宫颈癌治疗的靶基因。但HPV是严格的嗜上皮病毒,人是唯一宿主,现在暂无合适的体外培养模型。通过借助重组DNA技术,可将HPV的全基因或部分基因克隆到适当载体中,转染细胞,得到各种永生化细胞系,从而得到各种肿瘤研究的体外细胞模型。本研究中的Ect1/E6E7作为高危型HPV16感染载体,是体外研究HPV在宫颈癌前病变发生过程中作用的理想模型。从抗病毒角度研究出发,我们发现鸦胆子素D有以下几点作用及机制。
3.1 鸦胆子素D对HPV16亚型感染细胞的体外增殖具有抑制作用 Ect1/E6E7细胞是具有永生化能力的宫颈癌前病变细胞株,MTT法检测结果显示,经不同浓度鸦胆子素D体外作用,Ect1/E6E7细胞体外生长和永生化状态受到抑制,表现为作用浓度越高、时间越长,则细胞的体外生长抑制作用越明显。根据MTT法检测结果,当鸦胆子素D作用浓度为10 μ mol/ L甚至更高时,Ect1/E6E7细胞的增殖抑制情况趋于平台期,因此我们在接下来的实验中,选取了鸦胆子素D的1、5和10 μmol/L浓度作为研究浓度。
3.2 鸦胆子素D可诱导和促进HPV16亚型感染细胞的凋亡 研究发现,鸦胆子油乳在体外对某些宫颈癌细胞具有抑制作用,其机制可能为药物诱导了细胞的凋亡程序[3,15-16]。本课题之前的研究也证实了鸦胆子油乳对Ect1/E6E7细胞具有促进凋亡作用[1-2]。鸦胆子素D作为鸦胆子油乳中的提取物,其药物作用可能与之类似。Ect1/E6E7细胞因转染HPV16 E6、E7基因使得细胞永生化,而实验中,Ect1/E6E7细胞在鸦胆子素D的体外作用下出现了与宫颈癌Caski细胞相似的生长抑制现象,提示HPV16 E6、E7基因的表达可能收到抑制,也可能与细胞凋亡程序的诱导相关。
本实验通过Hoechst33258染色法发现,经鸦胆子素D作用后Ect1/E6E7细胞在荧光显微镜下可观察到细胞核呈碎块状浓染,有凋亡小体出现,提示细胞凋亡。Annexin V-FITC/PI双染色法显示,经1、5及10 μ mol/L鸦胆子素D体外作用48 h的细胞凋亡率逐渐升高,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。可见,鸦胆子素D体外作用Ect1/E6E7细胞可诱导和促进细胞凋亡,抑制细胞体外增殖。
3.3 鸦胆子素D抑制HPV16亚型感染细胞体外增殖能力的作用机制 为进一步探讨鸦胆子素D对HPV16亚型感染细胞的体外增殖抑制与促进细胞凋亡作用是否与HPV16主要病毒癌基因E6、E7介导的细胞永生化机制被阻断相关,本研究通过Real-time PCR法检测各不同浓度鸦胆子素D体外作用Ect1/E6E7细胞48 h后HPV16E6与E7基因mRNA的相对表达量。本实验中以Caski细胞作为阳性对照,设置空白对照组,结果显示Caski细胞中E6、E7 mRNA下调明显,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。而Ect1/E6E7细胞中E6、E7 mRNA有下调,但是差异无统计学意义。推测鸦胆子素D对细胞的生长抑制作用可能是作用于病毒癌基因E6、E7,由于Ect1/ E6E7细胞内HPV病毒拷贝量比Caski细胞低,因此表现出鸦胆子素D对Caski细胞有更明显的下调E6、E7表达的作用;另一方面,Ect1/E6E7细胞具有永生化能力,但并不是恶性肿瘤细胞,而Caski细胞是严格意义上的癌细胞,两者在癌基因的活化、抑癌基因的失活、表观遗传突变等分子方面应该有很多不同,因此在对抗肿瘤药物的敏感性上可能也存在差异,癌细胞可能对抗肿瘤药物敏感性更高。细胞内病毒定量检测亦证实了Caski细胞E6、E7病毒拷贝量远高于Ect1/E6E7细胞。说明从癌前细胞到癌细胞是个量变到质变的过程,当E6、E7蛋白表达量达到一定程度时,正常细胞基因水平产生变异,导致细胞的恶变。
综上所述,鸦胆子素D体外作用HPV16阳性细胞可能是通过下调其病毒癌基因E6、E7的表达,从而诱导和促进HPV16亚型阳性细胞的凋亡,抑制病毒感染细胞的持续增殖。本研究从抗病毒角度探讨了药物对癌前病变细胞的作用机制,在抗高危HPV感染及治疗与高危HPV感染密切相关的宫颈病变方面提出了新的研究方向。
[1]潘镏镏, 章圣辉, 胡燕, 等.鸦胆子油乳对宫颈永生化细胞体外增殖和凋亡的作用[J].中国妇幼保健杂志, 2013, 28 (5): 834-837.
[2]胡燕, 万小洁, 潘镏镏, 等.鸦胆子油乳对HPV16亚型感染细胞的作用及机制研究[J].中国中西医结合杂志, 2013, 33(11): 1545-1551.
[3]罗小秀, 高晓光, 周隆.鸦胆子治疗宫颈癌及其作用机制的研究进展[J].中国现代医生, 2010, 48(9): 15-16.
[4]Liu JH, Qin JJ, Jin HZ, et al.A new triterpenoid from Brucea javanica[J].Arch Pharm Res, 2009, 32(5): 661-666.
[5]Pan L, Chin YW, Chai HB, et al.Bioactivity-guided isolation of cytotoxic constituents of Brucea javanica collected in Vietnam[J].Bioorg Med Chem, 2009, 17(6): 2219-2224.
[6]Yu YL, Lu Y, Tang X, et al.Formulation, preparation and evaluation of an intravenous emulsion containing Brucea javanica oil and Coix Seed oil for anti-tumor application[J].Biol Pharm Bull, 2008, 31(4): 673-680.
[7]刘晖杰, 许华, 宁四清.鸦胆子油乳注射液联合DX方案治疗晚期胃癌临床研究[J].实用医院临床杂志, 2010, 7(6): 76-77.
[8]李烜, 吴华.鸦胆子油乳滴注液联合化疗治疗晚期非小细胞肺癌的临床观察[J].临床肺科杂志, 2010, 15(2): 266-267.
The effect of Bruceine D on high-risk human papillomavirus 16 infected cell and its possible mechanism
PAN Liuliu1, ZHENG Feiyun2, ZHU Haiyan2, ZHANG Shenghui2, HU Yan2.1.Department of Gynecology and Obstetrics, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.Department of Gynecology and Obstetrics, the Frist Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015
Objective:To investigate the Bruceine D’s (BD) effect on human papillomavirus (HPV) type 16 infected cell in vitro.Methods:The Ect1/E6E7 was cultivated with BD (1, 5, 10, 15 and 30 μmol/L) for 24, 48 and 72 h, the anti-proliferation effect was measured with MTT colorimetric assay; The Ect1/E6E7 was cultivated with BD (1, 5 and 10 μmol/L) for 24, 48 and 72 h, the cell growth cycle change was measured with cell cycle staining solution, the morphologic changes of cell apoptosis stained with Hoechst 33258 in the Ect1/E6E7 cell line were observed under fuorescence microscope treated with BD at concentration of 5 μmol/L for 48 h.Flow cytometry of Annexin V-FITC/PI assay was used to evaluate the apoptosis rate of Ect1/E6E7 cell line treated with BD at different concentrations (1, 5 and 10 μmol/L) in vitro.Cervical cancer cells Caski which contain complete HPV 16 E6, E7 gene, as a positive control, by real-time quantitative PCR to detect the mRNA expression of HPV E6, E7 of those two cells treated with BD.Results: Immortalized human ectocervical Ect1/E6E7 cell line treated with BD showed obviously morphological changes, and with the prolongation of drug action and the increase of drug concentration, the morphological changes became more apparent.BD can inhibit the proliferation of Ect1/E6E7 cell in dose-dependent and time-dependent manner (P<0.05).Ect1/E6E7 cell growth cycle was stagnated in the G1 phase.Hochest fuorescence staining presented the Ect1/E6E7 cells nucleus appeared apoptotic morphological change, and apoptotic bodies can be observed.Flow cytometry showed the apoptosis rate were(6.25±0.76)%, (20.21±1.32)%, (8.61±1.59)%, respectively, after 48 hours cultured with 1, 5, 10 μmol/L of BD (P<0.05).Real-time PCR results showed that after cultivating with 1, 5, 10 μmol/L BD for 48 h, the expression of HPV16 E6, E7 mRNA of Ect1/E6E7 cell were decreased, but compared with the control group, the difference was not statistically signifcant (P>0.05).The expression of HPV16 E6, E7 mRNA of Caski cell were decreased, the difference was statistically signifcant (P<0.05) compared with the control group.Conclusion:BD can inhibit the proliferation of Ect1/E6E7 cells signifcantly, the possible mechanism may be associated with the expression decline of HPV16 E6, E7 mRNA, which promote cell apoptosis.
human immortalized cervical cell; Bruceine D; proliferation; apoptosis; human papillomavirus 16
R711.74
A
10.3969/j.issn.2095-9400.2015.02.003
2014-05-20
浙江省中医药管理局科研项目(2011ZB089)。
潘镏镏(1986-),女,浙江温州人,住院医师,硕士。
胡燕,主任医师,Email:hywjz123@sina.com。