缺氧时乳腺癌细胞HIF-1α与CXCR4表达及迁移调控的实验研究

通信作者：郭丽英，女，硕士，主任医师，博士生导师，研究方向：乳腺外科，E-mail: 2315365607@qq.com。

缺氧时乳腺癌细胞HIF-1α与CXCR4表达及迁移调控的实验研究

付明刚1， 哈丽旦·肉孜2， 郭丽英1

(1新疆医科大学第一附属医院乳腺外科, 乌鲁木齐830054，2乌鲁木齐市杭州路卫生服务中心, 乌鲁木齐830026)

摘要：目的探讨缺氧时乳腺癌细胞缺氧诱导因子HIF-1α(HIF- 1α) 与趋化因子4(CXCR4)的表达及其对乳腺癌细胞迁移调控的影响。方法将MDA-MB-231乳腺癌细胞置入缺氧盒中,建立3%缺氧微环境，设为缺氧24 h组及缺氧48 h组，对照组为正常培养的乳腺癌细胞；采用MTT法测定乳腺癌细胞的增殖能力, RT-PCR法检测HIF-1α与CXCR4mRNA表达量，同时检测添加维生素C(VitC)后HIF-1α与CXCR4mRNA的mRNA表达水平：Transwell小室测定各组细胞的迁移能力。结果与对照组比较，缺氧24、48 h组细胞增殖能力明显增加；缺氧24 h组、缺氧48 h组HIF-1α、CXCR4 mRNA表达和细胞的迁移能力明显高于对照组(P<0.05) ; 缺氧24 h+VitC组、缺氧48 h+VitC组HIF-1α、CXCR4 mRNA表达和细胞的迁移能力与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论缺氧能增加细胞的增殖能力，能增加乳腺癌细胞HIF-1α、CXCR4mRNA表达和迁移能力,但能被抗氧化剂VitC有效阻断，提示HIF- 1α可望成为抑制乳腺癌转移的治疗靶点。

关键词：缺氧; 缺氧诱导因子- 1α; CXCR4; 乳腺癌

基金项目：省部共建国家重点实验室培育基地—新疆重大疾病医学重点实验室专项(SKLI-XJ-MDR-ZX-2014-1)

作者简介：付明刚 (1978-), 男，在读博士，主治医师，研究方向：乳腺外科。

中图分类号：R34

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.03.010

[收稿日期：2014-09-10]

Experimental research of the expression of HIF-1 alpha and CXCR4 and

regulation of the migration in hypoxic breast cancer cells

FU Minggang1, Halidan Rouzi2, GUO Liying1

(1DepartmentofBreastSurgery,FirstAffiliatedHospital,XinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830054,China;2TheHealthCenterofHangZhouRoad,Urumqi830026,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expressions of hypoxia inducible alph (HIF-1α) and chemokine receptor 4 (CXCR4) and the influence of the regulation of cell migration in hypoxia breast cancer cells. MethodsThe MDA-MB-231 breast cancer cell was put into Hypoxic box Hypoxic box, and then the hypoxic environment was constructed. The cells were divided into control group, hypoxia 24 h group and hypoxia 48 h group. The breast cancer cells in the control group were cultured without any interference. The researchers used MTT to test breast cancer cell proliferation ability and RT-PCR method to detect mRNA expression amount of HIF-1α and CXCR4 and their expression level after adding VitC. The cell migration ability of each team was determined by Transwell methods. ResultsThe proliferation of the cells in hypoxia 24 h group and hypoxia 48h group significantly increased compared to that in the control group. HIF-1α, CXCR4 expression and cell migration in hypoxia 24h group and hypoxia 48h group were significantly higher than that in the control group (P<0.05). The differences in HIF-1α, CXCR4 expression and cell migration between the hypoxia 24 h+VitC group and control group and between hypoxia 48 h+VitC group and control group were not statistically significant (P>0.05). ConclusionHypoxia can increase the proliferative capacity of breast cells and increase HIF-1α, CXCR4 expression and migration of the breast cancer cells, but these processes can be effectively inhibited by the antioxidant VitC. It suggests that HIF-1α is expected to become a new target to inhibit the process of the metastasis in breast cancer.

Key words: hypoxia; HIF-1α; CXCR4; breast cancer

乳腺癌是女性最常见的肿瘤，且乳腺癌的发病率呈增高趋势[1]。虽然以手术为主的综合治疗可以取得较好的临床疗效,但复发和转移仍然是影响患者生存率和死亡率的主要因素，尤其转移是绝大多数患者癌症晚期的症状和致死的主要原因[2]。目前乳腺癌转移潜在的分子机制目前尚未完全阐明。缺氧诱导因子1α(HIF-1α)作为多种信号途径的上游调控因子调控细胞凋亡、糖酵解、血管新生等多种肿瘤代谢过程，促进肿瘤生长。近年来，趋化因子受体在乳腺癌发展中的作用得到了广泛关注，尤其是趋化因子受体(CXCR4)与其配体SDF-1 形成的CXCR4 /SDF-1轴在肿瘤生长、侵袭和转移中也具有重要作用[3-4]。有研究表明缺氧可能与CXCR4在乳腺癌发生发展过程中诱导因子有协同作用[5]。但是，缺氧对乳腺癌HIF-1α、CXCR4 的表达及维生素C(VitC)相关作用机制及其影响却鲜有报道。本实验通过观察缺氧对乳腺癌细胞HIF-1α、CXCR4 表达及迁移能力的影响以及与VitC相关作用机制，期望为临床治疗乳腺癌提供理论依据。

1材料与方法

1.1试剂与材料高侵袭性人乳腺癌细胞系MDA-MB-231(上海信然生物科技有限公司)，CXCR4 抗体为Abcam 公司产品，维生素C(VitC)，1640 培养液及胎牛血清均为Gibco公司产品，Transwell 小室购自北京乐博生物科技有限公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养MDA-MB-231 乳腺癌细胞用含10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 U/mL卡那霉素的1640 培养液，于37℃、5%CO-2培养箱中培养，常规换液传代。

1.2.2缺氧培养方案将MDA-MB-231乳腺癌细胞先放入缺氧盒中,使用缺氧混配器(长沙长锦公司)将气体(3% O-2、5%CO-2及90%N)混合,并将混合后的气体注入缺氧盒,从而建立缺氧微环境。实验分为缺氧24 h 组、48 h组和正常对照组(正常培养的乳腺癌细胞)，每组实验为6次后取均值。

1.2.3MTT法测定乳腺癌细胞的增殖率将缺氧干预后的细胞用0.25%胰蛋白酶液消化，收集细胞，调节细胞浓度为1×10+4/mL，于96孔板每孔加0.2 mL，同时设空白对照组，只加入培养基，37℃分别培养24 h和48 h后，弃去培养液，PBS洗1次，每孔加0.1 mL PBS和10 μL MTT染液，在37℃、5%CO-2培养箱中培养4～6 h。弃去培养液，每孔加DMSO100 μL，震荡，在酶联免疫检测仪上选择570 nm 波长，测定每孔的光密度值(OD值)。

1.2.4RT-PCR法检测HIF-1α与CXCR4 mRNA表达水平及添加VitC后HIF-1α与CXCR4mRNA的mRNA表达水平按照以上分组收集处理后的细胞，Trizol法提出总RNA，逆转录为cDNA后进行PCR。PCR反应体系为：Mix：10 μL，HIF-1α上游引物:5′-GGAAACTTCTGGATGCTGGTGAT-3′，下游引物:5′-CACTTCATTCTGAGAAAAAAGCTTC-3′，扩增片段 310 bp。CXCR4上游引物5′-AGGTGGTCTATGTTGGCGTCTGGAT-3′,下游为5′-AGGATGGGGATGATTGTGGTCTTGA-3′,SDF-1各1 μL，扩增片段大小291 bp。cDNA:1.5 μL，dd H-2O：6.5 μL，总计20 μL。取PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳35 min，以β-actin基因作为内参照，采用GDS8000凝胶自动成像仪扫描分析并相对处理。

1.2.5Transwell小室实验检测细胞迁移能力细胞按照各组处理后加入上室内，下室内加入含SDF-l(200 nM)的500 μL的培养液，各组细胞在趋化因子诱导下可穿过多孔滤膜，由小室的上室面迁移至小室的下室面，0.1%的结晶紫染色20 min(结晶紫用无水甲醇配成0.5%的母液，用时稀释成0.1%)，PBS清洗2次，24孔板加入PBS，10%乙酸(100 μL)溶解，将溶解的液体转入96孔板中用酶标仪读数(OD=560 nm),结果用倍数比表示各组数据，对照组定为100%，其他各组数据与对照组进行比较得到倍数比,实验重复3次。

1.3统计学处理使用SPSS13.0统计软件完成统计学处理，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间差异比较采用单因素方差分析, P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1缺氧对乳腺癌细胞增殖能力的影响与正常对照组比较，在缺氧24 h后，3%缺氧组细胞增殖能力显著升高(P<0.05)(A 值表示乳腺癌细胞的增殖程度)；而且24 h缺氧组与48 h缺氧组比较细胞增殖能力无明显变化(P>0.05)，见表1。

表1　3%缺氧对MDA-MB-231 增殖的影响( ±s)

表1　3%缺氧对MDA-MB-231 增殖的影响( ±s)

分组检测次数A值正常对照组60.12±0.0283%缺氧24h组60.21±0.0213%缺氧48h组60.22±0.047

注：注：与正常对照组比较,*P<0.05。

2.2缺氧对乳腺癌HIF-1α和CXCR4 mRNA的影响与正常对照组比较，3%缺氧24 h、48 h组细胞HIF-1α和CXCR4 mRNA显著升高(P<0.05)(表2)，但3%缺氧24 h+VitC和3%缺氧48 h+VitC 组细胞与对照组比较无明显差异(P>0.05),见图1、2，表2。

图1　缺氧24 h对乳腺癌HIF-1α和CXCR4 mRNA表达的影响

图2　缺氧48 h对乳腺癌HIF-1α和CXCR4 mRNA

分组检测次数R值24h48h正常对照组62.562.863%缺氧组65.656.623%缺氧+VitC组63.013.22

注：注: R值为相对mRNA水平，与正常对照组比较,*P<0.05。

2.3Transwell小室测定各组细胞迁移能力与正常对照组比较，3%缺氧24 h组、48 h组细胞迁移能力明显升高(P<0.05)，但3%缺氧24 h+VitC和3%缺氧48 h+VitC 组细胞与正常对照组比较迁移能力无明显差异(P>0.05)，见图3～5。

A: 正常对照组

B：3%缺氧组

C：3%缺氧+VitC组

图33%缺氧24 h组乳腺癌细胞迁移能力

A: 正常对照组

B：3%缺氧组

C：3%缺氧+VitC组

图43%缺氧48 h组乳腺癌细胞迁移能力

3讨论

缺氧是实质性肿瘤局部微环境的基本特征之一。越来越多的研究表明缺氧是决定恶性肿瘤预后的重要因素,缺氧不仅可以促进肿瘤细胞的生长,更重要的是缺氧还可以诱导肿瘤细胞的转移和浸润性生长[6-7]，但其机制尚不清楚。

HIF-1是哺乳动物细胞在缺氧条件下产生的一种转录因子,主要由HIF-1α、HIF-1β2个亚基组成。

图5　各组乳腺癌细胞迁移能力比较

正常条件下，各组织HIF-1α的表达甚少，而低氧状态时，则表现为时间及低氧程度依赖性升高[8]。HIF-1广泛参与哺乳动物细胞中缺氧诱导产生的特异应答，介导机体的整体和局部缺氧反应，在缺氧诱导的基因表达调节中起着关键作用。 研究表明HIF-1α在多种恶性肿瘤,如乳腺癌、卵巢癌等的原发灶、转移灶、侵袭性癌细胞的前沿部位高表达,拮抗HIF-1α活性可以抑制肿瘤的形成和转移扩散[9]。基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)属化学趋化因子超家族，其特异性的受体CXCR4是G蛋白偶联的7次跨膜受体，目前研究发现CXCR4 在多种肿瘤高表达,并可能在肿瘤发展、转移中发挥重要的作用[10-11]。本实验结果表明, 缺氧条件下的MDA-MB-231细胞的增殖能力明显增加，HIF-1α水平和迁移能力明显增加,说明缺氧增加MDA-MB-231细胞迁移可能与HIF-1α的表达有关。本研究通过RT-PCR 法从基因水平检测CXCR4 在乳腺癌细胞的表达,并分析其功能，结果显示缺氧能上调MDA-MB-231细胞CXCR4表达且增加其的迁移能力,提示缺氧可能与CXCR4表达和乳腺癌迁移能力增加有关。Kim等[7]对79 例手术切除的乳腺浸润性导管癌组织进行的研究表明, 所有患者的癌组织均表达CXCR4, 而高表达尤其是局灶性高表达者伴有广泛的淋巴结转移, 进一步说明CXCR4可能参与乳腺癌的淋巴转移。

VitC作为抗氧化刺，可以减少自由基的生成,能够有效拮抗缺氧引起的细胞损伤[12]。为了进一步探讨其机制，本研究观察抗氧化剂VitC对缺氧是否有拮抗作用，结果显示VitC能够有效抑制缺氧增加的HIF-1α和CXCR4 mRNA，并能抑制缺氧条件下细胞的迁移能力。说明缺氧可能通过增加乳腺癌细胞缺氧诱导因子HIF-1α表达、CXCR4表达及乳腺癌细胞迁移的迁移能力，为临床移植乳腺癌转移提供新的思路和治疗靶点。

综上所述，缺氧能增加细胞的增殖能力，能增加乳腺癌细胞HIF-1α、CXCR4mRNA表达和迁移能力，但能被抗氧化剂VitC有效阻断，可能为预防乳腺癌转移提供新的思路。

参考文献：

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(本文编辑杨晨晨)