维吾尔族和汉族女性散发性乳腺癌BRCA1及BRCA2基因单核苷酸多态性研究

通信作者：张巍，女，主任医师，博士生导师，研究方向：肿瘤分子病理学，E-mail:zwyhr100@163.com。

·民族肿瘤学·

维吾尔族和汉族女性散发性乳腺癌BRCA1及BRCA2基因单核苷酸多态性研究

缑文斌， 王智， 苗娜， 张巍

(新疆医科大学第一附属医院病理科， 乌鲁木齐830054)

摘要：目的研究新疆汉族及维吾尔族女性散发性乳腺癌患者BRCA1及BRCA2基因单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)的差异。方法收集新疆医科大学第一附属医院手术切除并经病理确诊为乳腺癌100例患者的活检样本,维吾尔族和汉族患者各50例。BRCA1基因引物设计参考NM_007300.3和NC_000017.11，BRCA2基因引物设计参考NM_000059.3和NC_000013.11,合成引物后对BRCA1及BRCA2基因SNP位点进行测序，采用SPSS17.0统计软件对数据进行卡方检验。结果在BRCA1-Exon10上有2个单核苷酸多态性位点(rs16941及rs16942)。BRCA1-Exon2内含子上有1个突变位点(Introns1-1125)。BRCA2基因未检测到基因多态性。BRCA1基因，rs16941位点的AA、AG、GG 3个基因型在汉族和维吾尔族患者中的分布频率差异有统计学意义(P=0.009)。rs16942位点的AA、AG、GG 3个基因型在汉族和维吾尔族患者中的分布频率差异有统计学意义(P=0.017)。rs16941位点，相对于AA基因型，AG、GG基因型能增加维吾尔族乳腺癌患者的易感性[OR值(95%CI)分别为2.498(1.033～5.994)及6.519(1.606～26.464)]。rs16942位点，相对于AA基因型，AG、GG基因型能增加维吾尔族乳腺癌患者的易感性[OR值(95%CI)分别为2.368(0.995～5.637)及5.741(1.395～23.630)]。结论BRCA1基因，rs16941及rs16942位点的AA、AG、GG 3个基因型的分布频率在汉族和维吾尔族患者中存在差异。rs16941及rs16942位点，相对于AA基因型，AG、GG基因型能增加维吾尔族乳腺癌患者的易感性。

关键词:乳腺癌; BRCA1及BRCA2基因; 单核苷酸多态性; 种族差异

基金项目：新疆维吾尔自治区科技支疆计划项目(201291172)

作者简介：缑文斌(1981-)，男，在读硕士，主治医师，研究方向：肿瘤病理学。

中图分类号：R737.9

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.03.007

[收稿日期：2014-10-20]

Research about single nucleotide polymorphisms of BRCA1 and BRCA2

gene between Han and Uyghur female patients with sporadic breast cancer

GOU Wenbin， WANG Zhi， MIAO Na, ZHANG Wei

(DepartmentofPathology,FirstAffiliatedHospital,XinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830054,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate differences in single nucleotide polymorphisms (Single Nucleotide Polymorphisms, SNP) of BRCA1 and BRCA2 genes between Han and Uygur female patients with sporadic breast cancer in Xinjiang. MethodsWe collected biopsy samples of 100 patients who had undergone surgical removal and had been pathologically diagnosed as breast cancer sufferers, including 50 Uyghur and 50 Han in The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University. BRCA1 gene primer was designed according to NM_007300. 3 and NC_000017. 11. BRCA2 gene primer was designed according to NM_000059. 3 and NC_000013. 11. The gene sequencing of BRCA1 and BRCA2 was decided after synthetic primer. The data were analyzed by SPSS17.0 statistics software. ResultsThere were two locus(rs16941 and rs16942) of single nucleotide polymorphisms on the BRCA1-Exon10. Another a mutation locus (Introns1-1125) was found on BRCA1-Exon2 introns. BRCA2 gene polymorphism was not detected. Statistically significant differences were found in the frequency distribution of genotype AA, AG and GG on rs16941 (P=0.009) and rs16942 (P=0.017)of BRCA1 between Han and Uygur patients. Compared with the AA genotype, the susceptibility of Uyghur patients with breast cancer was increased in AG and GG genotypes (odd ratio (95% CI): 2.498 [(1.033-5.994) and 6.519 (1.606-26.464)]as well as in rs16942 locus (odd ratio (95% CI): 2.368 [(0.995-5.637) and 5.741 (1.395-23.630)]. The relationship between BRCA1 gene rs16941 and rs16942 locus and the clinical pathological characteristics were analyzed, whereas there were no statistical differences. ConclusionSignificant differences were found in the genotype AA, AG and GG on rs16941 and rs16942 of BRCA1 between Han and Uygur patients. In rs16941 and rs16942 locus, AG and GG genotypes might increase the susceptibility of Uyghur patients with breast cancer.

Key words： breast cancer; BRCA1 and BRCA2 gene; Single Nucleotide Polymorphisms; ethnic difference

新疆是我国维吾尔族最主要聚居区，维吾尔族乳腺癌患者在日常临床工作中所占比重较大。近年来，维吾尔族妇女乳腺癌发病率逐年增高，且大多数发现较晚，以Ⅱ、Ⅲ期居多，严重地危害着妇女的身心健康。目前国内外的研究发现乳腺癌的易感基因主要有BRCAl/2、C-MYC、ORAI1、Rad-3相关蛋白(ATR)、细胞周期检查点激酶1(CHEK1)、切除修复交叉互补基因1(ERCC1)、DNA修复基因XPF、人类表皮生长因子受体2(HER-2)、细胞周期素1(cyclinD1)、成纤维细胞生长因子受体2(FGFR-2)及其受体基因等[1-5]，其中BRCAl及BRCA2基因与乳腺癌发病风险高度相关，是乳腺癌最主要的易感基因。乳腺癌BRCA1及BRCA2基因作为肿瘤抑制基因，其结构与功能的异常与乳腺癌的发生、发展及预后密切相关。而SNP与突变是基因结构与功能改变的主要原因。乳腺癌BRCA1及BRCA2基因突变位点众多，且不同种族的高发突变位点存在差异[6-8]，其中BRCA1基因以外显子(exon)2、10、20的突变多见，BRCA2基因以外显子(exon)11的突变多见[8]。本研究选择100例散发性乳腺癌(50例汉族和50例维吾尔族)，对BRCA1的外显子2、10、20及BRCA2的11号外显子进行SNP位点的检测，旨在比较新疆汉族和维吾尔族乳腺癌患者BRCA1和BRCA2基因多核苷酸多态性是否存在差异,现报道如下。

1材料与方法

1.1标本来源收集2004年12月-2014年3月由新疆医科大学第一附属医院手术切除并经病理医师确诊为乳腺癌的100例活检样本。维吾尔族和汉族乳腺癌患者各50例，年龄为27～76岁，平均年龄48岁。所有患者均为散发性乳腺癌患者，无明确肿瘤家族史。

1.2基因组DNA的提取方法将肿瘤组织蜡块按5 μm厚度切片3～5张，收集于EP管中，按照基因组DNA提取试剂盒QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen，Cat#56404)说明书进行DNA提取。提取产物经核酸蛋白定量仪NanaDrop 2000检测DNA浓度，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整程度。合格标准OD260/OD280>1.6,浓度>30 ng/μL,琼脂糖凝胶电泳有主带。

1.3PCR扩增及基因型分析所有核酸序列位置编码参考NCBI GenBank 中野生型 cDNA 序列 BRCA1(U14680.1)和 BRCA2(U43746.1)。BRCA1基因引物设计参考NM_007300.3和NC_000017.11，BRCA2基因引物设计参考NM_000059.3和NC_000013.11，序列详见表1。合成引物后，收集质检合格的100例DNA样本，在预先配置好的PCR反应体系中进行扩增。反应体系为30 μL，包括模板DNA模板0.6 μL，10×PCR缓冲液(含Mg2+)5 μL，10 mmol/L dNTP 混合物 0.6 μL，Pfu DNA聚合酶(Tiangen,EP101)0.3 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各 0.6 μL。反应条件: 95℃ 5 min; 95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，共40个循环。取PCR 产物 5 μL 经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR产物利用Applied Biosystems 3730XL DNA Analyser测序。测序图形用Chromas Pro 1.33软件分析。

1.4数据分析所有核酸序列位置编码参考美国NCBI GenBank 中野生型 cDNA 序列 BRCA1(U14680.1)和 BRCA2(U43746.1)。所检测到的突变位点在乳腺癌信息中心网站数据库(Breast Cancer InformationCore，BIC) 比较，确定是否为新的突变位点。对其中发现的变异位点行Hardy-Weinberg平衡检验，确定其是否符合遗传平衡定律。进一步利用SPSS17.0 统计软件对变异位点进行卡方检验， P<0.05 为差异有统计学意义。

表1　PCR引物序列、反应条件及扩增条件

2结果

2.1BRCA1及BRCA2基因单核苷酸多态性检测结果在BRCA1-Exon10上有2个突变位点(rs16941及rs16942),均引起错义突变,导致rs16941位点谷氨酸(Glu)改变为甘氨酸(Gly),rs16942位点的赖氨酸(Lys)改变为精氨酸(Arg)。在BRCA1-Exon2内含子上有1个突变位点(Introns1-1125)。BRCA2基因未检测到基因单核苷酸多态性位点,见表2。

2.2BRCA1基因rs16941及rs16942位点Hardy-Weinberg平衡检验BRCA1基因rs16941及rs16942位点经Hardy-Weinberg平衡检验，差异无统计学意义，见表3。

表2　BRCA1Exon10及BRCA1Exon2上SNP检测突变位点信息

　　注：Glu：谷氨酸; Gly：甘氨酸; Lys：赖氨酸; Arg：精氨酸。

2.3BRCA1基因rs16941及rs16942位点及Introns1-1125内含子分型图将PCR扩增产物利用Applied Biosystems 3730XL DNA Analyser测序和基因型分析,测序图形用Chromas Pro 1.33软件分析,见图1。

2.4BRCA1基因rs16941及rs16942位点在维吾尔族和汉族患者中的分布rs16941位点在汉族和维吾尔族患者中有AA、AG、GG 3种基因型，汉族3种基因型的频率分布为64%、30%、6%，维吾尔族3种基因型的频率分布为36%、42%、22%，3种基因型的频率分布差异有统计学意义(P=0.009)。相对于AA基因，AG和GG基因型可能增加维吾尔族乳腺癌患者的易感性，OR值(95%CI)分别为2.498(1.033～5.994)及6.519(1.606～26.464)。rs16942位点在汉族和维吾尔族患者中有AA、AG、GG 3种基因型，汉族3种基因型的频率分布为62%、32%、6%，维吾尔族3种基因型的频率分布为36%、44%、20%，3种基因型的频率分布差异有统计学意义(P=0.017)。相对于AA基因型，AG和GG基因型可能增加维吾尔族乳腺癌发病的易感性，OR值(95%CI)分别为2.368(0.995～5.637)及5.741(1.395～23.630)，见表4。BRCA1Exon2 Introns1-1125位点仅汉族中1例病人发生内含子突变，无临床意义。

A：BRCA1Exon10 rs16941位点AA基因分型图；B：BRCA1Exon10 rs16941位点AG基因分型图；C：BRCA1Exon10 rs16941位点GG基因分型图；D：BRCA1Exon10 rs16942位点AA基因分型图；E：BRCA1Exon10 rs16942位点AG基因分型图；F：BRCA1Exon10 rs16942位点GG基因分型图；G：BRCA1Exon2 内含子Introns1-1125位点TT基因分型图；H：BRCA1Exon2 内含子Introns1-1125位点GT基因分型图

图1　BRCA1基因rs16941及rs16942位点及Introns1-1125内含子分型图

3讨论

BRCA1定位于人类17号染色体q21，以常染色体显性遗传方式遗传，并有很高的外显率。BRCA1是一种肿瘤抑制基因，在染色体上的跨度大约为100 kb，编码区为55.5 kb，含高达41.5的Alu重复序列，含24个外显子。BRCA1作为抑癌基因在基因表达与转录调控、基因突变及DNA 损伤和修复等多个方面发挥作用，与乳腺癌的发生、发展及预后密切相关[9]。BRCA2基因定位于13号染色体q12，在染色体上的跨度大约为70 kb，其中编码区含有10 987 bp，且富含AT(约64%)，其基因序列与BRCA1无明显关系。BRCA2由27个外显子组成，BRCA2与双链DNA损伤修复有关，但具体作用模式与机制仍不清楚[9]。 当其发生突变时，发生遗传性乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌及前列腺癌的概率也明显增加[10]。

SNP是继限制性片段长度多态性、DNA单链构象多态性之后出现的第三代遗传标记。SNP是疾病易感性、药物敏感性等生物性状差异的重要遗传学基础。因此SNP的相关研究将会为疾病的诊断、预防和治疗等个体化医疗发展提供重要数据基础和理论依据。乳腺癌的发病风险与SNP位点和易感基因的突变个数及其本身的危险性呈高度相关，突变个数越多，突变的SNP位点和易感基因的危险性越高，发生乳腺癌的概率也就越大[7]。

国外研究发现BRCA1基因SNP多态性位点超过120个，其中10个位于BRCA1基因的编码区[5]。而不同民族、不同地区乳腺癌BRCA1基因SNP位点改变也不尽相同，SNP作为乳腺癌的易感因素对乳腺癌发生、发展的作用也不尽相同。Chen等[11]研究发现rs1271572位点的TT基因型能增加乳腺癌的患病风险且与较差的预后密切有关。Vahtefist等[12]研究显示，Pro24Ser和ValS07Met等位基因的SNPs能够降低乳腺癌的患病风险。孙刚等[13]对新疆维吾尔族乳腺癌BARD1基因多态性的研究发现，Pro24Ser(C/T)、Arg378Ser(G/C)及Val507Met(G/A)位点的SNPs改变能够显著降低新疆地区维吾尔族早发性乳腺癌的发病风险，并且各位点之间存在显著的协同作用和交互作用。

本研究选择50例汉族及50例维吾尔族乳腺癌患者作为研究对象，对其BRCA1及BRCA2基因SNP位点进行测序，比较其在汉族及维吾尔族乳腺癌患者中是否存在差异。结果发现在BRCA1Exon10上有2个突变位点(rs16941及rs16942),均引起错义突变，导致rs16941位点谷氨酸(Glu)改变为甘氨酸(Gly)，rs16942位点的赖氨酸(Lys)改变为精氨酸(Arg)。1例汉族乳腺癌患者BRCA1-Exon2内含子上有1个突变位点(Introns1-1125)。BRCA2基因未检测到基因多态性。BRCA1基因，rs16941位点的AA、AG、GG 3个基因型在汉族和维吾尔族患者的频率分布差异有统计学意义(P=0.009)。rs16942位点的AA、AG、GG 3个基因型在汉族和维吾尔族患者的频率分布差异有统计学意义(P=0.017)。rs16941位点，相对于AA基因型，AG、GG基因型能增加维吾尔族乳腺癌患者的易感性[OR值(95%CI)分别为2.498(1.033～5.994)及6.519(1.606～26.464)]。rs16942位点，相对于AA基因型，AG、GG基因型能增加维吾尔族乳腺癌患者的易感性[OR值(95%CI)分别为2.368(0.995～5.637)及5.741(1.395～23.630)]。因此，BRCA1基因rs16941及rs16942位点的AA、AG、GG 3个基因型在汉族和维吾尔族患者间存在差异。相对于AA基因型，AG、GG基因型改变可能与维吾尔族乳腺癌发病的易感性增高有关。Cox等[6]研究发现携带稀有等位基因C的野生型BRCA1基因的rs16942位点能降低乳腺癌的发病风险(OR值0.86, 95%CI 0.77～0.95)。Luisel等[14]研究发现rs16941位点与乳腺癌易感性之间无明确的关系。上述研究与本研究结果不一致，可能与SNP在不同的民族、地区的分布及研究对象的选取及标本量较小等有关。

综上所述，本研究对50例汉族及50例维吾尔族乳腺癌BRCA1及BRCA2基因进行SNP位点测序，并对实验结果进行分析。BRCA1基因rs16941及rs16942位点，相对于AA基因型，AG、GG基因型改变可能与维吾尔族乳腺癌的发病易感性增高有相关性。但是，因为本研究样本量较小，且选择研究的对象均为散发性乳腺癌,因此要详细阐明乳腺癌BRCA1基因与SNP的关系，还需要对不同地区、不同种族进行多位点、大样本的深入细致的研究。

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(本文编辑杨晨晨)