新疆特高发肿瘤资源库中冷冻组织质量鉴定标准的研究

通信作者：王喜艳，男，主任医师，博士生导师，研究方向：胰腺肿瘤的基础和临床，E-mail: wangxiyan2415@163.com。

新疆特高发肿瘤资源库中冷冻组织质量鉴定标准的研究

郭文佳， 朱琳， 张园， 董翔， 葛慧, 王喜艳

(新疆医科大学附属肿瘤医院新疆肿瘤防治研究所， 乌鲁木齐830011)

摘要：目的在新疆特高发肿瘤资源库中建立冷冻组织质量鉴定体系。方法选取肿瘤资源库中食管癌、宫颈癌、肝癌冷冻组织及正常对照组织各10例，利用HE染色技术检测标本取材的准确性，琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA质量，琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，Western-blot鉴定蛋白质质量。结果HE染色观察检测标本肿瘤部分占80%以上， 28s/18s为1.8～2.0，蛋白质及DNA质量均完整无降解。结论建立了一个规范化的冷冻组织质量控制体系，可以作为肿瘤资源库标本质量鉴定的常规方法。

关键词：肿瘤资源库； 冷冻组织； 质量鉴定

基金项目：国家自然科学基金(81460361); 乌鲁木齐市科学技术计划项目(Y111310045)

作者简介：郭文佳(1984-)，女，硕士，助理研究员，研究方向：哈萨克族食管癌发病机理。

中图分类号：R197.324

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.03.002

[收稿日期：2014-11-19]

On the quality identify for frozen tissues from the Xinjiang tumor

resource bank

GUO Wenjia, ZHU Lin, ZHANG Yuan, DONG Xiang, GE Hui, WANG Xiyan

(TumorResearchInstitute,TumorAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a standard protocol for quality control of frozen tissues in the Xinjiang-Tumor Resource Bank. MethodsTen frozen tissues and normal control tissues of cervical cancer esophagus cancer and hepatocellular carcinoma were respectively randomly selected，stained with HE and pathologically checked. Agarose electrophoresis was used to detect the quality of the DNA. Agarose electrophoresis used to check the RNA quality. Western blot was used to detect the quality of the protein from these frozen tissues. ResultsHE staining showed that all the detected samples contained 80% or greater tumor. 28s/18s ratio were respectively 1.8-2.0. The good quality of the protein and DNA from these frozen tissues was observed. ConclusionWe have established a standard quality control system, which is applicable as a routine method in quality control of frozen tissues from the tumor resource bank.

Key words: tumor resource bank; frozen tissue; quality identify

目前在世界范围内开始进行肿瘤分子分型和个体化诊治的研究[1]。这项研究能否获得实质性进展取决于一个最基本的问题，即研究用生物样本的质量和数量，包括符合临床诊治规范的临床研究队列，高质量、严格按照标准化操作流程(standard operation procedure，SOP)收集的组织样本和详细的临床、病理、治疗和随访等资料[2-3]。高质量的肿瘤组织标本在肿瘤的科学研究过程中扮演了至关重要的角色，是开展肿瘤科学研究工作的基础。为了保护新疆特高发肿瘤资源，新疆特高发肿瘤资源库收集和保存新疆常见肿瘤患者的血液、体液和组织标本，并对其进行质量鉴定和科学地管理，现已初步形成制度化、标准化、规范化的肿瘤标本收集、存储和管理体系。为在新疆特高发肿瘤资源库中建立冷冻组织质量鉴定体系，本研究以新疆特高发肿瘤资源库-80℃低温下存储的冷冻组织标本为材料，总结出一整套完整的冷冻组织标本质量鉴定的标准化操作流程，现报道如下。

1 材料与方法

1.1组织标本的留取选取新疆特高发肿瘤资源库2011年1月-2013年12月-80℃低温冰箱中冻存的食管癌、宫颈癌、肝癌冷冻组织标本各10例，选取的组织标本包括肿瘤组织和远端正常组织。

1.2HE染色冷冻组织标本先放置在室温中解冻，标本库工作人员对组织标本块进行常规脱水、石蜡包埋、切片操作、HE染色。由病理科资深诊断医师对切片进行病理学检查，确认取材部位与病理诊断是否一致，检测组织标本的代表性，肿瘤部分在80%以上为合格标本。

1.3DNA抽提与鉴定冷冻组织总DNA抽提参照百泰克生物工程有限公司提供的基因组DNA提取试剂盒说明书进行。基因组DNA提取以后，利用全波长分光光度计检测稀释过的DNA提取物A值，并根据测定时DNA稀释比例换算提取DNA浓度，总DNA经1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪下观察冷冻组织标本DNA的完整性。

1.4RNA抽提与鉴定冷冻组织总RNA提取参照Sigma公司提供的Trizol 试剂盒操作说明书进行。全波长分光光度计测定经稀释的RNA提取物的A 值，根据测定RNA提取物的稀释比例换算出提取RNA浓度。判断RNA纯度的标准：A260/ A280为1.8～2.0。总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳，检测提取RNA的完整性，完整的总RNA显示明亮的28s和18s条带，并且28s的亮度是18s的2倍。RT-PCR：将抽提的总RNA逆转录为cDNA，内参照选择GAPDH。GAPDH上游引物：5’-ACGCCAGCGCTCCTAGT-3’， GAPDH下游引物：5’-CGAAGATGACCCGGAAGA-3’。PCR 扩增条件：94℃ 3 min；94℃ 3 min，55℃，30 s；72℃，35 s，共35个循环；72℃，5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.5蛋白质提取与鉴定冷冻组织标本蛋白质提取：-80℃低温冰箱中取出冷冻组织标本，取约100 mg组织加入细胞裂解液研磨，放入4℃离心机， 12 000 r/min 离心30 min，取上清液。Western-blot法鉴定蛋白质质量：制备SDS-PAGE胶，其中浓缩胶5%,分离胶10%，制备的蛋白样品放于95℃加热器中煮沸3 min，蛋白质变性。电泳每孔20 μg变性蛋白质上样。浓缩胶使用80 V电压电泳，分离胶使用100 V电压电泳。在温度4℃电压、100 V的条件下，将蛋白转到PVDF膜上，转膜时间90 min。结束后加入1∶1 000稀释的α-actin单克隆抗体，温度4℃孵育过夜。第2天用加入0.1% Tween20的1×TBS洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗人二抗1∶5 000稀释，在室温中孵育30 min，洗涤3次后加ECL试剂显色1 min，立即放入全能型成像系统曝光后观察结果。

2结果

2.1HE染色结果所有受检组织细胞染色清晰，形态良好，对比鲜明(图1)，肿瘤细胞比例超过80%。

A：食管鳞癌

B：宫颈鳞癌

C：肝细胞癌

图1管癌、宫颈癌和肝癌组织 HE 染色结果(×100)

2.2DNA质量鉴定30例冷冻组织标本的全基因组DNA，电泳可见条带清晰(图2)，DNA保存良好。

2.3RNA质量鉴定抽提30例冷冻组织标本总RNA，各取100 ng，Agilent 2100毛细管电泳，结果如图3所示。28s/18s比值为1.8～2.0，RNA琼脂糖凝胶电泳以及内参照GAPDH RT-PCR，结果均显示RNA质量好(图3)。

2.4冷冻组织抽提的蛋白质质量鉴定应用α-actin单抗识别冷冻组织中相对应的抗原，结果显示受检样本均可见明显的目的条带(图4),提示受检冷冻组织蛋白保存良好。

图2　冷冻组织标本DNA电泳

3讨论

本研究介绍了新疆特高发肿瘤资源库中冷冻组织标本的质量鉴定流程，使用这个标准化流程对肿瘤资源库自建库以来的冷冻组织标本进行随机抽样检查，结果显示库存标本质量较好。为保证患者的利益，在保证组织块足够用于病理诊断的前提下留取组织标本，否则可能导致术中冰冻报告失误，影响术者的术中决策和术后治疗指导。肿瘤资源库工作人员在遇到某些早期肿瘤患者肿瘤体积小、甚至是原位癌时，杜绝盲目留取，此时的最佳处理方式是放弃。

A：RNA琼脂糖电泳； B：GAPDH RT -PCR产物琼脂糖电泳

图4　冷冻组织标本的蛋白Western blot结果

一般术中标本留取操作程序如下：肿瘤资源库取材人员首先对手术切除的大体标本进行观察，确认肿瘤的部位与范围，并在肉眼下与周围异己组织进行鉴别，在大体标本离体后的最短时间内切取标本；再将标本切取成多块直径为0.5 cm左右的组织块，分别装入已编号的无核酶的灭菌冻存管中，迅速置入液氮罐中冻存，半小时后转移至-80℃超低温冰箱，并进行纸质标本资料登记和信息录入系统。

肿瘤资源库中储存的冷冻组织，常被用于基因芯片、PCR、Western-blot等多种分子生物学实验，因此研究可靠的首要前提是每个冷冻组织标本中肿瘤细胞所占的百分比。Sandusky等[4]报道，作为研究所用的标本，肿瘤部分占 65% 以上才能符合要求，本研究将组织切片中肿瘤部分所占整体标本的比例80%以上作为标本鉴定的主要方案之一[5]。

本研究发现，大部分标本的RNA样品A260/ A280为1. 8～2.0，说明RNA有较高的纯度；电泳可见明显的28s和18s条带，而且28s的亮度大约是18s条带的2倍，说明提取的总RNA基本没有降解，具有较好的完整性[6-7]。有3例标本在取材中离体时间较长，提取的RNA样本A260/A280<1.8，而且电泳显示28s和18s 2条条带不清晰，有明显拖尾，提示RNA已经降解，应重新提取进行实验验证，如果结果相同则对该标本进行备注。

总之，本研究介绍一套较为完整的肿瘤资源库冷冻组织质量鉴定的操作流程，方法经典可靠，经过反复验证，能够保证新疆特高发肿瘤资源库库存冷冻组织标本用于各项分子生物学实验。在今后的发展中，不仅可以满足自身研究的需要，还可向其他单位的科研工作者提供高质量的冷冻组织标本，有利于有效地利用现有的库存肿瘤资源，最大程度地促进医学研究的发展。

参考文献:

[1]Moore HM, Compton CC, Alper J, Vaught JB. International approaches to advancing biospecimen science[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2011, 20:729-732.

[2]McDonald S, Velasco E, Ilasi NT. Business process diagrams in tissue bank informatics system design, and identification and communication of best practices: the pharmaceutical industry experience[J]. Biopreserv Biobanking, 2010,8:203-209.

[3]王青, 林爱芬, 周文君,等. 人体组织生物样本库的建立和应用[J].中华医院管理杂志, 2010, 26(2):150-153.

[4]Sandusky GE, Teheny KH, Esterman M, et al. Quality Control of human tissues-experience from the Indiana University Cancer Center-Lilly Research Labs human tissue bank[J].Cell Tissue Bank,2007,8(4):287-295.

[5]包卫光,林爱芬,章霞,等. 组织生物样本库中冷冻组织质量鉴定体系的建立[J].温州医学院学报,2010,40(5):472-474.

[6]Barraclough DL, Sewart S, Rudland PS, et al. Microarray analysis of suppression subtracted hybridisation libraries identifies genes associated with breast cancer progression[J].Cell Oncol,2010,32(1-2):87-99.

[7]Lam KB, Yin P, Jiang CQ, et al． Past dust and GAS/FUME exposure and COPD in Chinese: The Guangzhou Biobank Cohort Study[J]．Respir Med, 2012, 106:1421-1428．

(本文编辑周芳)