大鼠肝泡球蚴病模型早期超声造影表现与病理对照分析

通信作者：刘文亚，女，主任医师，教授， 博士生导师， 研究方向： 腹部疾病及包虫病的多模态影像学诊断， E-mail：dr_lwyykdx@163.com。

大鼠肝泡球蚴病模型早期超声造影表现与病理对照分析

曾红春1， 王静2， 刘文亚2， 王颖鑫1， 王俊华3

(新疆医科大学第一附属医院1超声诊断科，2影像中心，3基础医学和包虫病研究所， 乌鲁木齐830011)

摘要:目的探讨超声造影揭示早期大鼠肝泡球蚴病灶血流灌注的价值。方法开腹直视下肝内感染泡球蚴9 w的33只大鼠，进行常规超声、超声造影检查，详细记录不同检查方法的影像特征，并与病理对照。结果常规超声和超声造影筛查早期大鼠肝泡球蚴病灶的敏感性分别为91.67%和81.82%。超声表现主要表现为高回声型(29/33,87.88%)和混合性回声(4/33,12.12%)，经病理证实所有病灶均表现为单个或多个囊泡样结构。33个病灶彩色多普勒超声均未显示血流信号，14个病灶(14/30,46.67%)超声造影显示为动脉期环状强化，14个病灶(14/30,46.67%)显示动脉期及门脉期环状强化伴内部分隔强化，2个病灶(2/30,6.66%)未见明显强化。超声造影显示的增强区域，经病理证实为泡球蚴病灶周边富含微血管的炎性反应带。结论常规超声在筛查大鼠肝泡球蚴病中，较超声造影具有较高的灵敏度，然而，超声造影可以显示病灶内部的囊泡和病灶内部及周边的血流灌注情况。

关键词：泡球蚴； 肝脏； 超声

基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金(2014211C039)

作者简介：曾红春(1977-)，女，博士，副主任医师，副教授 ，硕士生导师，研究方向：浅表及腹部器官疾病的超声诊断，包虫病的影像学诊断。

中图分类号：R445.1

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.03.015

[收稿日期：2014-06-03]

Contrastive analysis of contrast-enhanced ultrasonography in assessing

early infection stage in rat with hepatic alveolar echinococcosis

ZENG Hongchun1, WANG Jing2, LIU Wenya2, WANG Yingxing1, WANG Junhua3

(1DepartmentofUltrasonography,2ImagingCenter,3XinjiangKeyLabofFundamental

MedicalResearchandXinjiangHydatidClinicalResearchInstitute，TheFirstAffiliatedHospital

ofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo assess the effectiveness of Contrast-enhanced ultrasonography (CEUS) in screening for hepatic alveolar echinococcosis (HAE) at early infection stage in rat model. Methods33 rats were intraheptacilly infected with E. mutilocularis, Utrasonography (US) and CEUS features of HAE lesions were recorded after 9 weeks post infection, compared with pathology, and the accuracy and effectiveness of US and CEUS were assessed according to the principle of diagnostic test. ResultsUS and CEUS had a high sensitivity of 91.67% and 81.82% in screening the early HAE in rats. The typical ultrasonographic features of HAE lesions were hyper-echoic(29/33,87.88%), and 4 lesions presented mixed pattern (4/33,12.12%). Single or multiple milky white or beige cyst-like nodules containing fluid were observed in the liver by using pathological examination. Hematoxylin-eosin (HE) staining showed that the small cyst was surrounded by the characteristically proliferated small blood vessels and infiltrated inflammatory cells. CDFI failed to detect blood flow signals in 33 lesions. CEUS results for 14 lesions (14/30,46.7%) showed ring enhancement in the peripheral area during the arterial phase and no filling effect in either the portal or the delayed phase and ring enhancement combined with central septa enhancement during the arterial phase and portal venous phase (14/30,46.7), and no enhancement in 2 lesions (2/30,6.6%). The enhanced area, confirmed by pathologic examination, was an inflammatory reaction belt surrounding the lesion. ConclusionThis study suggests that US, with higher sensitivity, can be recognized as a screening method for early HAE lesions in the animal model, while CEUS can be used for displaying the peripheral and internal blood perfusion.

Key words: Alveolar echinococcosis; hepatic; contrast-enhanced ultrasonography

肝泡球蚴病(Hepatic Alveolar Echinococcosis, HAE)由多房棘球绦虫感染、以小囊泡增殖的方式逐渐侵蚀周围组织及血管[1]，具有类似恶性肿瘤的生物学方式。在该病的临床诊断中，影像学(超声、CT、MRI)常被作为常用的检查方法，其典型表现已有报道[2-4]，由于该病病理演变复杂多变，单凭传统影像学进行早期诊断仍存在困难[5-6]。鉴于该病具有严重致病性，如未经及时治疗，病死率可高达90%。因此，寻求一种新的方法，作为早期诊断的补充，具有非常重要的临床意义。本研究通过建立大鼠感染肝泡球蚴早期阶段的动物模型，运用超声造影观察早期大鼠肝泡球蚴病灶的血流灌注模式，旨在确定血管化特征在早期肝泡球蚴病灶中的诊断价值，以期为该病提供早期诊断的客观依据。

1材料与方法

该研究已获新疆医科大学第一附属医院伦理委员会审查通过(批准号：20110224001)。

1.1实验动物选用新疆医科大学动物实验中心饲养的50只雌性SD大鼠，体质量(200±20) g。种鼠由新疆医科大学第一附属医院动物实验科学部提供。

1.2动物模型的制备无菌条件下，快速处死种鼠，剖腹取出新鲜泡状棘球蚴组织，去除多余的坏死组织。将余留的组织进行称重、剪刀剪碎、研磨器碾磨、细纱布过筛，制成细小组织匀浆。然后用0.9%生理盐水反复冲洗、沉淀，重复3～6次，将坏死组织及血细胞成分滤去。最后，剩余组织加适量的无菌生理盐水制成浓度为20%(20 000 个原头节/mL)的溶液，在溶液内加入适量青霉素和链霉素注射液进行除菌，药物浓度为250 U/mL，接种留用。开腹切口约0.5 cm，直视下选取大鼠肝脏较厚的肝左叶穿刺，注射器针头斜行进针，入肝实质内约1 cm 左右，注入20%原头节混悬液0.1 mL，纱布压迫止血，丝线逐层缝合关闭腹腔。

1.3超声造影检查接种后9 w，45只大鼠存活，超声筛查33只大鼠接种成功。检查仪器为Acuson Sequia 512(8～14 MHz)，选用CPS模式，机械指数为0.08～0.11，针对不同病灶调试增益、扫面范围和增益控制，注入造影剂后每次检查持续时间为5 min。造影剂为声诺维(SonoVue，意大利，博莱克公司)，主要成分为六氟化硫微泡。使用前注入5 mL 0.9%生理盐水，摇匀，配置成混悬液，留置备用。每只大鼠从尾静脉注入0.5 mL造影剂混悬液，随即用2 mL生理盐水进行冲管。

参照临床研究肝脏造影的各时相增强时间，动脉期定义为肝动脉开始显影的时期，此时周围肝组织仍然为低回声；门静脉期为肝内门静脉开始显影，同时肝实质开始增强，此时肝动脉的造影剂增强开始减低；肝实质增强减低时为延迟相，此期肝实质回声减退。所有的检查结果均储存在工作站内(蓝韵公司，深圳，中国)。造影增强模式：仅有周边增强无内部增强为环状强化；周边及内部同时增强，为环状增强伴内部分隔增强。

1.4图像解释和分析所有的影像资料由两名影像科医生进行评价，评价内容包括病灶数目，内部回声、病灶的最大直径，病灶增强模式。依据病灶的超声表现和大小，将图像分为两种类型：高回声型：表现为点状高回声、簇状细小高回声、灶状高回声；混合回声型：病灶内部呈高回声伴圆形/类圆形无回声至极低回声。

1.5病理组织学检查超声造影检查结束后，采用颈椎离断的方法快速处死大鼠，剖腹取出肝脏组织，观察病灶的大体，测量大小及形态，留取资料图。按取材要求切取标本，10%甲醛固定、脱水、透明、石蜡包埋、切薄片(厚约5 μm)，进行HE染色、Masson染色、免疫组化染色。

1.6统计学分析采用SPSS13.0 统计软件，所有的病灶直径采用计量资料的方式进行记录，比较超声造影和常规超声测量病灶直径是否有差异用配对t检验的方法，检验标准α=0.05 。超声造影检查和常规超声在肝泡球蚴病灶中的灵敏度和特异度用RevMan 5.0软件进行分析。

2结果

2.1大鼠肝泡球蚴病灶常规超声及彩色多普勒超声表现经超声检查共检出30只大鼠感染成功，共33个病灶。28只大鼠肝内有1个病灶，1只大鼠有2个病灶，1只有3个病变。超声测量最大病灶直径16 mm，最小病灶直径1 mm。3个病灶因直径<1 mm不能被超声所显示。超声筛查大鼠肝泡球蚴病灶的敏感性和特异性分别为91.67%和100%。29个病灶(29/33，87.9%)表现为高回声型(图 1)，4个病灶(4/33, 12.1%)表现为混合性回声(图 2)，所有的病灶内部均未见血流信号。

2.2大鼠肝泡球蚴病灶的超声造影检查超声造影检出27只大鼠感染成功，共30个病灶。病灶最大直径18 mm，最小直径2.5 mm。6只大鼠共6个病灶，由于直径<2 mm无法被超声造影所发现。超声造影的敏感性和特异性分别为81.82%和 100%。 超声造影测量的病灶直径为 (5.18±0.58) mm，稍大于常规超声测量的病灶直径(4.39±0.48) mm，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3大鼠肝泡球蚴病灶不同超声造影增强模式与病灶直径、超声表现的关系环状增强模式(14/30, 46.67%) 10个病灶直径≤3 mm，在常规超声上表现为点状高回声，4个病灶(3～6 mm)常规超声表现为密集点状高回声。超声造影表现为动脉期环状强化，内部无强化，门静脉早期出现廓清，中央始终无增强(图 3)。环状强化伴中央分隔增强(14/30，46.67%) 10个病灶(3～6 mm)常规超声表现为灶状高回声，4个直径≥7 mm的病灶超声表现为肝内边界清晰的混合性病灶，内呈高回声伴无回声及低回声。超声造影表现为动脉期及门脉期环状强化伴中央分隔增强(图 4)。无增强(2/30,6.66%) 病灶直径<2 mm，超声造影各时期均未见增强，与肝实质强度一致。

图1肝内可见高回声病灶(箭头)

图2肝内混合性病灶(箭头)其内可见类圆形囊泡

图3肝内高回声灶超声造影呈环状增强(箭头)

图4肝内混合回声灶(箭头)呈内部分隔增强

2.4大鼠肝泡球蚴病灶不同增强模式与病理对照超声造影表现为环状强化的病灶(10/30,33.33%)经病理证实为单个米黄色或乳白色囊泡样结构(图 5)，囊内含少量黏液及乳白色物质，HE染色表现为中央红染囊泡样结构，周边可见与正常肝组织分界不清的环状炎性反应带(图 6)，其内含肉芽组织、纤维组织、以及小血管结构，其间可见上皮细胞，巨噬细胞，成纤维细胞和淋巴细胞。Masson染色可清晰显示蓝染的纤维结构(图 7)。

超声造影表现为环状强化伴分隔强化的14个病灶(14/30,46.67%)及4个环状增强的病灶(4/30,13.33%)，经病理证实为乳白色多囊泡样结构，囊内含较多量黏液及乳白色物质。在HE染色上表现为多个红染的囊泡样结构，内壁可见细小芽生囊泡结构(图 8)，各囊泡结构间及整个病灶周边可见宽窄不一的炎性反应带。2个未显示强化的病灶(2/30,6.67%)在病理表现为单个囊泡样结构，HE染色可见体积较小的红染结构，周边不伴明显的炎性反应区。

图5乳白色囊泡结构外突于肝脏(箭头)

图6HE染色示病灶周边炎性反应区(箭头)

图7Masson染色蓝染部分为纤维组织(箭头)

图8HE染色多囊泡样结构伴芽生组织(箭头)

3讨论

多房棘球蚴由大小不一(直径1～10 mm)的小囊泡集聚而成，在宿主组织内通过外生性出芽增殖方式呈浸润性缓慢生长。该病的早期诊断是提高治愈率的关键。早期由于受成像技术的限制，影像学很难显示病灶内部的囊泡样结构。近几年，部分学者[7-8]通过运用MR技术成功显示病灶内部多囊泡结构，并证实病灶呈多囊泡样表现是肝泡球蚴生长的早期阶段，为采用影像学诊断肝泡球蚴病灶提供了影像学依据。本研究建立肝泡球蚴早期感染阶段的大鼠动物模型，拟模拟肝泡球蚴病灶的早期阶段，所有病灶均经病理证实为单个或多个囊泡样结构，因而，本研究采用接种后9 w的大鼠肝泡球蚴模型，作为肝泡球蚴病早期阶段的研究是有理论依据的。

直径较小(≤3 mm)的病灶，主要表现为动脉期环状强化，内部无强化，类似增强方式在人类肝泡球蚴病灶[9]及脑泡球蚴[10]中均见报道。王静等[11]通过CT灌注技术反映病灶的血管化状态，提出泡球蚴周边的高灌注区域与泡球蚴的活性状态有密切关系，此区域在病理上表现为富含微血管及炎性细胞的环状区域。本研究采用的声诺维造影剂可反映病灶的微血流灌注[12]，因此，超声造影显示的环状增强区为大鼠泡球蚴病灶周缘的炎性反应区。

直径较大的病灶(≥5 mm)表现为动脉期和门静脉期病灶周边环状强化伴内部分隔强化。此型病灶在病理上均呈现为多囊泡样结构，病灶周缘及部分囊泡结构周缘均可见类似小病灶周边的炎性反应区。病灶的直径不同，呈现了不同的增强模式，该结果表明直径较小病灶的血供主要是来自肝动脉，随着病灶的逐渐增大，小动脉进行性破坏，周边的门静脉逐渐参与供血，因而，直径较大的病灶中出现门静脉期增强的特征。

有学者报道超声表现为高回声伴极低或无回声区的泡球蚴病灶，处于肝泡球蚴病灶生长阶段的较早期[9]。但上述病灶未经过病理证实，本研究观察33个大鼠肝泡球蚴病灶感染早期阶段的超声表现，经病理证实均为含液性成分的囊泡样结构。依照超声成像原理，囊性结构在超声上应表现无回声或极低回声。然而，本研究中大多数病灶(29/33，87.9%)表现为高回声，分析原因主要是由于小病灶内部液性成分较少，且周边被较厚的纤维组织结构包裹，在超声上形成强反射，因而超声现象为高回声灶。随着病灶的逐渐增大，囊泡内液性成分亦增多，囊性结构才可被超声所显示。

本研究中生长周期相同的肝泡球蚴病灶，病灶的大小及内部结构表现不同，分析原因可能是由于不同个体对泡球蚴组织的免疫反应不同。该现象表明泡球蚴组织在肝内的初始生长方式可以是单个囊泡样结构，也可是多个囊泡样结构。2个直径<2 mm的病灶在各期均未增强，经病理证实病灶周边无明显的炎性反应带，因此超声造影后增强特征不明显。肝泡球蚴病灶大小的准确测量，对于动态评价治疗效果非常重要。常规超声由于不能准确显示病灶的边缘，因此不能准确反映病灶的大小。本研究中，所有病灶经超声造影测量的结果都比常规超声大，分析原因可能是由于超声造影可显示病灶周边的炎性反应区。

总之，常规超声在筛查肝泡球蚴病中，较超声造影具有较高的灵敏度，然而，超声造影可以显示更为详细的内部结构，尤其是病灶内部的囊泡和病灶周边的血流灌注区。因此，超声造影可作为诊断超声表现不典型的肝泡球蚴病灶的一种补充检查方法。

参考文献：

[1]Vuitton DA，Bresson-Hadni S,Giraudoux P, et al. Alveolar echiniococcosis:from an incurable rural disease to a controlled urban infection[J]. Presse Med,2010,39(2):216-230.

[2]Wang J, Xing Y, Ren B, et al. AIveolar echinococcosis:Correlation of imaging type with PNM stage and diameter of lesions[J]. Chin Med J,2011,124(8):2824-2828.

[3]Kantarci M, Bayraktutan U, Karabulut N, et al. Alveolar echinococcosis:spectrum of findings at cross-sectional imaging[J]. Radiographics, 2012, 32(7):2053-2070.

[4]Li T, Chen X, Zhen R, et al. Widespread co-endemicity of human cystic and alveolar echinococcosis on the eastern Tibetan Plateau, northwest Sichuan/southeast Qinghai, China[J]. Acta Trop, 2010,113(3):248-256.

[5]Ito A, Nakao M, Sako Y. Echinococcosis:serological detection of patients and molecular identification of parasites[J]. Future Microbiol, 2007,2(4):439-449.

[6]Sako Y, Fukuda K, Kobayashi Y, et al. Development of an immuno- chromatographic test to detect antibodies against recombinant Em18 for diagnosis of alveolar echinococcosis[J]. J Clin Microbiol, 2009, 47(1):252-254.

[7]Kodama Y, Fujita N, Shimizu T, et al . Alveolar Echinococcosis:MR findings in the liver[J]. Radiology, 2003, 228(1):172-177.

[8]Becce F, Pomoni A, Uldry E, et al. Alveolar echinococcosis of the liver:diffusion- weighted MRI findings and potential role in lesion characterisation[J]. Eur J Radiol,2014,83(4):625-631.

[9]Ehrhardt AR, Reuter S, Buck AK, et al. Assessment of disease activity in alveolar echinococcosis:a comparison of contrast-enhanced ultrasound, three-phase helical CT and 18F fluoroxyglucose positron- emission tomography[J]. Abdom Imaging, 2007, 32(6):730-736.

[10]田兄玲，刘丛学，张黎敏,等. 脑泡状棘球蚴病兔脑动物模型建立[J]. 新疆医科大学学报，2014, 37(7):866-868.

[11]王静,任波,刘文亚,等. 肝脏泡球蚴病CT灌注成像与微血管密度及血管内皮生长因子的相关性分析[J].中华放射学杂志, 2011,45(11):1036-1039.

[12]曾红春,王晓荣,王玉杰,等.超声造影在鉴别诊断肾囊性病灶良恶性的价值[J].新疆医科大学学报,2012,35(8):1096 -1099.

(本文编辑张巧莲)