长双歧杆菌BBMN68菌株的耐氧驯化研究

文/李转羽 宋静颐 刘松玲 葛绍阳 刘 力 桑 跃 武永超 张建铭 刘治麟 赵 亮*

（1中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京市高等学校畜产品工程研究中心；2江西鸿燕健康科技有限公司；3北京和益源生物技术有限公司）

双歧杆菌是一种重要的益生菌，对人体有多种益生功能。长双歧杆菌BBMN68来源于健康长寿老人肠道，有研究证明BBMN68具有调节免疫[1，2]、调节肠道菌群、改善便秘[3]等作用，是优良的益生菌。

双歧杆菌属于专性厌氧菌，对氧气敏感，这使其在加工、包装和贮藏过程中极易产生氧中毒，进而导致活力降低，从而限制其进一步的生产应用。由于双歧杆菌细胞内无过氧化氢酶，有氧气存在时，细胞无法分解代谢所产生的过氧化氢，而过氧化氢对碳水化合物代谢系统中的果糖-6-磷酸酮酶活性有不可逆的阻碍作用[4～6]。此外，有氧时，细胞内的某些酶及辅酶因被氧化而失活，也会造成代谢障碍。因此，如何提高双歧杆菌的耐氧性是促进其广泛应用的关键问题。

目前，提高双歧杆菌耐氧性能的方法主要有微胶囊法[7]和耐氧菌株驯化法2 种。相比于微胶囊法，通过耐氧驯化获得耐氧菌株的方法不仅可以避免双歧杆菌在益生菌制品的加工、包装、贮藏和摄入过程中失活，还可以降低生产中对发酵工艺及设备的要求，从而减少产品生产成本[8]，有利于双歧杆菌BBMN68的大规模应用，是一种非常具有发展前景的方法。

本研究采用逐渐增加氧分压[4]的方法驯化BBMN68菌株，增强其在产品中的稳定性，为今后驯化其它厌氧性菌株提供参考，同时也为BBMN68的大规模应用提供条件。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株

长双歧杆菌BBMN68，由教育部-北京市共建功能乳品重点实验室提供。

1.1.2 培养基

MRS培养基：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，牛肉膏10 g，葡萄糖20 g，吐温80 1 mL，无水乙酸钠5 g，磷酸氢二钾2 g，柠檬酸氢二铵2 g，四水合硫酸锰0.25 g，七水合硫酸镁0.58 g，蒸馏水1 L；pH值为6.5。

MRSC培养基：MRS培养基中每升添加半胱氨酸0.5 g；MRSC固体培养基：MRS培养基中每升添加琼脂15 g；MRSC耐胆盐培养基：MRSC培养基中的吐温80含量改为1.5%，胆盐含量根据试验要求添加；深冷保护剂：12%脱脂乳中加入30%甘油。

所有培养基均在121 ℃高温下高压蒸汽灭菌15 min。

1.1.3 主要试剂及来源

半胱氨酸盐酸盐：美国AMRESCO公司；琼脂糖G-10：西班牙Biowest公司；牛胆盐（生物试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；D2000 DNA Marker，2×Taq PCR MasterMix，细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）：天根生物技术有限责任公司；Loading Buffer：日本Takara公司。

1.1.4 主要仪器及设备

WFZ UV-2102PC型紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；DNP-9082型电热恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；TGL-16B台式离心机：上海安亭科学仪器厂；LDZM立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；DYY-6C型电泳仪：北京六一仪器厂；SW-CJ-2FS洁净工作台：苏州佳宝净化工程设备有限公司；DELTA320 pH计：METTLER-TOELDO公司；T100 PCR仪：美国伯乐公司；4400凝胶成像扫描仪：Gel-Pro公司；Infite200PRO酶标仪：Tecan公司；XSZ-4G显微镜：COIC公司。

1.1.5 16S rDNA的PCR扩增引物

上游引物：5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG -3’，下游引物：5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T -3’，均由Invitrogen生物技术有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 形态学鉴定

参考张苓花等方法[9]，挑取厌氧培养的MRSC固体培养基上的菌落进行革兰染色和镜检，观察菌体颜色、大小、分叉形状等是否符合双歧杆菌属的基本形态特征。

1.2.2 长双歧杆菌BBMN68的耐氧驯化

将镜检合格的菌液以5%接种量接种于灭菌的MRSC培养基中，将接种后的厌氧管放于37 ℃培养箱中培养。当培养基出现明显浑浊时进行传代。传代至第10次后，换MRS培养基继续传代至23 次，菌株生长达到稳定状态。

1.2.3 利用OD600nm筛选耐氧菌株

参照Talwalkar等方法[10]，将传代菌液进行10 倍梯度稀释后倒平板，37 ℃厌氧条件倒置培养48 h，从固体平板上挑取单菌落约30 个。将其接种、活化后，分别等量接种于pH值为6.5的MRS/MRSC培养基中。经过37 ℃、12 h的有氧/厌氧培养后，分别测定不同培养条件下的OD600nm，并计算有氧条件与厌氧条件下OD600nm的比值。

1.2.4 耐氧菌株16S rDNA序列鉴定

用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取驯化菌株DBBMN68的基因组，以基因组为模板，进行16S rDNA基因的PCR扩增，反应体系及反应条件如下。

PCR反应体系（50 µL）：Premix Ex Taq 25 µL，上游引物1.25 µL，下游引物1.25 µL，基因组模板2.5 µL，超纯水20 µL。

PCR扩增条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性15 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共34 个循环，最后72 ℃延伸3 min，反应结束。

PCR产物纯化后委托上海生工生物技术有限公司测序，得到的PCR产物序列通过BLAST在基因库中进行同源性比对，鉴定到种。

1.2.5 耐氧菌株耐酸能力测定

37 ℃活化待测菌株15 h后，分别以2%的接种量分别接种于pH值2.5、3.0和6.5的MRSC培养基中。37 ℃下分别培养0、0.5、1和2 h，对驯化菌株与原始菌株进行平板计数。每组试验至少有2 个重复。

1.2.6 耐氧菌株耐胆盐能力测定

37 ℃活化待测菌株15 h后，分别以1%的接种量接种于含0%、3%、5%胆盐的MRSC耐胆盐培养基中。每隔2 h测定一次菌液的OD600nm，一直持续12 h。每组试验至少有3 个重复。

1.2.7 双歧杆菌的平板菌落计数

参考GB/T 4789.34-2003的方法，培养基改为MRSC固体培养基，培养条件为厌氧。

1.2.8 菌株保藏

将已经充分活化的菌种10 mL在4 200 r／min下离心15 min，弃去上清液，加入深冷保护剂2 mL，充分混匀，分装于200 µL离心管，于-20 ℃中保存。

2 结果与分析

2.1 长双歧杆菌BBMN68 耐氧驯化结果

由图1可知，传代初期，随着传代次数的增加，OD600nm值呈现缓慢上升的趋势，同时pH值不断下降，说明在这段期间，长双歧杆菌BBMN68的耐氧能力在稳步提高。传代10 次后，为了进一步提高培养环境中的氧分压，将培养基更换为MRS。随着传代次数增加，OD600nm值不断增大，且在传代第20次时达到最大值，而此时pH值较低。取传代第20次的菌株涂布法倒平板，获得单菌落进行革兰染色和镜检，观察菌体颜色、大小、形状、分叉形状等是否符合长双歧杆菌BBMN68的基本形态特征。挑取单菌落继续驯化至传代23 次，达到稳定状态。

图1 长双歧杆菌BBMN68 耐氧驯化结果

2.2 利用OD600nm筛选耐氧菌株结果

在整个驯化阶段的后期，传代第20次时，OD600nm达到最高值而pH值较低，根据1.2.3所述的方法从传代20 次的菌液中筛选菌株，试验数据如表1所示。

根据表1 试验数据中有氧OD600nm/厌氧OD600nm一项，筛选出耐氧能力最好的菌株，即比值最高的3 个菌株（序号分别为28、29和25）进行下一步试验，与原始菌株耐氧能力进行比较，结果见表2。

由表2可以看出，序号为25、28和29的3 个菌株，其有氧OD600nm/厌氧OD600nm一项均比原始菌株高，可知驯化后菌株的耐氧能力比原始菌株有一定的提高，说明通过逐渐增加氧分压的方法可以提高菌株的耐氧能力，这与李青青的研究结果一致[4]。通过耐氧驯化得到耐氧能力较强的菌株DBBMN68，即29号菌株。

2.3 耐氧菌株16S rDNA 序列鉴定结果

利用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取乳酸菌DBBMN68的基因组，结果如图2所示，所提基因组完整性较好，没有降解，可以进行PCR扩增。以基因组为模板，采用16S rDNA 引物进行PCR扩增，得到约1 500 bp的特异性扩增产物。PCR扩增产物纯化后委托生工生物技术公司完成测序，将测序结果在NCBI 网站上应用BLAST 软件在基因库中进行同源性比对。结果显示，驯化菌株DBBMN68的16S rDNA PCR扩增产物的核心序列与长双歧杆菌BBMN68的基因序列一致，因此鉴定乳酸菌DBBMN68为长双歧杆菌。

表1 驯化菌株在有氧与厌氧条件下的生长情况

表2 驯化菌株与原始菌株耐氧能力比较

2.4 耐氧菌株耐酸能力测定结果

图2 菌株DBBMN68 的基因组DNA 凝胶电泳图

根据1.2.5的方法对原始菌株和驯化后菌株的耐酸能力进行比较，结果见图3。原始菌株BBMN68与驯化菌株DBBMN68在对照组（pH值6.5）的2 h培养过程中活菌数呈上升趋势，而在试验组（pH值3.0）的相同时间培养过程中活菌数并没有增长，说明酸性环境对于长双歧杆菌BBMN68的生长具有抑制作用。原始菌株与驯化菌株在pH值3.0的酸性环境中培养2 h后活菌数没有显著性变化，说明驯化菌株维持了良好的耐酸性能。

2.5 耐氧菌株耐胆盐能力测定结果

根据1.2.6的方法对原始菌株和驯化后菌株的耐胆盐能力进行比较，结果见图4。原始菌株与驯化菌株在含0%及0.3%胆盐的培养基中的OD600nm值呈上升趋势，相比于含0.3%胆盐的培养条件，0%胆盐含量的2 菌株生长速度更快；而在含0.5%胆盐的培养基中的OD600nm值一直没有显著变化，说明胆盐对于长双歧杆菌BBMN68的生长有抑制作用。

在胆盐环境培养12 h过程中，驯化菌株与原始菌株的OD600nm值无显著性差异，说明耐氧驯化没有降低长双歧杆菌对胆盐的耐受能力。

图3 耐氧菌株DBBMN68 耐酸性能评价

图4 耐氧菌株DBBMN68 耐胆盐性能评价

3 小结与展望

通过逐渐增加氧分压的方法进行耐氧驯化，得到了1 株氧耐受性加强的长双歧杆菌，在MRS不充氮气的厌氧管中可以正常生长。经16S rDNA测序，鉴定该菌株仍为长双歧杆菌BBMN68。耐受性试验说明驯化菌株的耐酸能力和耐胆盐能力与原始菌株无显著差异，即在增加了耐氧能力的同时，仍基本保持了菌株原有的其它方面性能，确定了驯化菌株的稳定性，为益生菌BBMN68的广泛应用奠定了基础。

双歧杆菌属于专性厌氧菌，这一特性严重限制了其在生产、加工中的应用，而耐氧驯化作为针对这一问题的有效解决办法，具有很好的效果。同时驯化这一适应学原理不仅可以应用于耐氧，还可以应用于耐胆盐、耐热等其它方面，是一种很有应用前景的方法。

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