树突状细胞激活介导副干酪乳杆菌L9对CD4+T细胞的分化作用研究

文/杨 景 刘松玲 葛绍阳 刘 力 桑 跃 武永超 张建铭 刘治麟 赵 亮,*

（1中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京市高等学校畜产品工程研究中心；2江西鸿燕健康科技有限公司；3北京和益源生物技术有限公司）

CD4+T细胞在机体细胞免疫系统中有重要作用，初始CD4+T细胞（Naïve CD4+T）在机体内不同细胞因子的作用下，分化为一系列具有不同功能的细胞群。树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）是目前已知的体内功能最强的抗原呈递细胞，在机体的免疫调节中有重要功能。CD103+DCs，作为一种重要的调节性树突状细胞（regDCs），可通过分泌视黄酸和转化生长因子-β（TGF-β）等细胞因子，促进naïve CD4+T细胞向调节性T（Foxp3+Treg）细胞分化，在调节机体内的Th1/Th2免疫失衡和维持机体免疫自稳中起重要作用[1]。

益生菌可调节肠道微生态的平衡和肠黏膜免疫系统。研究表明，益生菌可以通过提高小鼠淋巴细胞中Foxp3+Treg细胞数量，调节小鼠炎症反应中的T细胞平衡[2]，而这种调节作用与其诱导DCs成熟、分化有关。已有研究表明，益生菌可以与DCs表面Toll样受体或C型凝集素受体等结合，诱导DCs成熟及细胞因子的分泌[3]，进而增加机体内Foxp3+Treg细胞数量，缓解风湿、肠炎和过敏性哮喘等免疫失衡性疾病症状[4，5]。

副干酪乳杆菌L9分离自健康人肠道。课题组前期研究表明，L9具有调节小鼠肠道免疫功能的生物学活性[6]。然而，L9是否通过调节DCs功能，促进CD4+T分化发挥免疫调节生物学活性尚不清楚。因此，本研究以骨髓源树突状细胞（BMDCs）为模型，研究L9对其细胞因子的分泌及CD103表达的影响，利用L9诱导后的BMDCs与小鼠脾CD4+T细胞联合培养，分析Foxp3+Treg细胞比例。

1 材料与方法

1.1 菌株

副干酪乳杆菌L 9（曾用名L14）由教育部功能乳品重点实验室提供。将实验菌株L9接种至MRS培养基中，37 °C培养至生长稳定期（12 h），将菌液4 500 r/min离心10 min后，用灭菌的0.01 mol/L、pH值7.4 PBS缓冲液重悬，调整菌液浓度为1.0×1010CFU/mL，100 ℃水浴30 min，经检验无活菌存在，且菌株保持正常形态。

1.2 试验动物

本研究动物为SPF级BALB/c小鼠，体质量18～22 g，6 周龄。饲养于中国农业大学食品学院动物房，环境温度24 ℃，湿度40%～60%，光照12 h，试验前静养1 周左右。

1.3 试剂

淋巴细胞分离液为天津灏洋生物制品科技有限责任公司产品；细胞因子检测试剂盒为R&D公司产品；RPM1640培养液购自美国Gibco公司；丝裂酶素C购自美国Sigma公司；重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、重组小鼠白细胞介素4（rmIL-4）购自美国Peprotech公司；流式抗体购自美国ebioscience公司。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓源树突细胞分离与培养

提取小鼠骨髓细胞，添加rmGM-CSF、rmIL-4诱导6 天后，收集细胞为BMDCs。调整细胞密度为2.0×106CFU/mL，接种于6 孔板中。设置空白组（CON），阳性对照组（LPS，1 μg/mL；Pam3C，1 μg/mL）和2 个试验组（L9菌悬液，一组浓度为1.0×106CFU/mL，一组为1.0×107CFU/mL）。每孔总体积为3 mL，每组设置3 个重复。连续培养24 h后，将细胞悬液离心，收集上清液用于细胞因子检测，收集细胞用于流式分析及后续实验。

1.4.2 树突状细胞与小鼠脾CD4+T细胞共培养

收集各组BMDCs，经丝裂霉素C灭活处理30 min，然后与小鼠脾淋巴细胞分离的CD4+T细胞（2.0×106CFU/mL）共培养（BMDCs︰CD4+T cell=1︰10），60 h后收集细胞，用于流式分析。

1.4.3 树突状细胞中CD103表达及CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞比例检测

收集各组BMDCs，添加单抗标记CD11c（FITC）、CD103（PE）和MHCII（PerCP-eFluor710），4 ℃下避光30 min，PBS缓冲液清洗，然后细胞悬浮于PBS缓冲液中，通过流式细胞仪检测CD103表达情况。

收集与树突状细胞共培养后的小鼠脾CD4+T细胞，添加单抗标记CD4（FITC），CD25（PE）和Foxp3（APC），通过流式细胞仪检测其表面抗原分子的表达情况，分析CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞比例。

1.4.4 细胞上清液中细胞因子水平检测

测定BMDCs细胞上清液中TGF-β和IL-10浓度，按照各ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.5 数据处理

采用SPSS12.5统计软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），Duncan’s multiple-comparison test分析组间差异，以P<0.05为显著性，各组数据以Mean±SD表示。

2 结果与讨论

2.1 L9 调节骨髓源树突状细胞因子分泌

树突状细胞可分泌调节性细胞因子，参与机体的免疫调节。由图1可以看出，与空白对照组相比，L9能够显著促进BMDCs分泌调节性细胞因子IL-10和TGF-β，且有剂量效应。高剂量L9促进TGF-β分泌增加了3.03 倍，高于阳性对照组；同时促进IL-10分泌增加了26.58 倍。

近年来的研究发现，DCs不仅是体内重要的抗原递呈细胞，而且对机体免疫反应发挥着重要的调节作用。在自身免疫性疾病中，分泌高水平调节性细胞因子（IL-10和TGF-β）的调节性DCs能够促进自身反应性淋巴细胞凋亡和诱导Treg细胞的生成，抑制多种炎性细胞因子的分泌，从而维持机体免疫耐受[1]。益生菌具有调节机体内细胞和体液免疫应答的功能，能够维持机体免疫系统健康和稳定。有研究发现，益生菌可以与DCs表面受体结合（如Toll样受体，C型凝集素受体等），诱导DCs功能，但存在菌株差异性[3，7]；益生菌可以提高小鼠肠系膜淋巴结的调节性DCs中IL-10和TGF-β的mRNA表达，促进Treg细胞增多，缓解小鼠肠道炎症[4]；长双歧杆菌可以调节BMDCs成熟状态，促进IL-10和TGF-β分泌，调节机体内Treg细胞增多，缓解小鼠花粉过敏反应[5]。

图1 L9 对骨髓源树突状细胞分泌细胞因子的影响

本研究结果表明，L9可以促进BMDCs分泌调节性细胞因子IL-10和TGF-β，具有调节CD4+T细胞向Foxp3+Treg细胞分化的潜能。

2.2 L9 调节骨髓源树突状细胞 中CD103表达

图2 L9对骨髓源树突状细胞中CD103表达的影响

CD103+DCs是参与机体免疫调节的一类重要的调节性DCs，可分泌调节性细胞因子，促进机体内Foxp3+Treg细胞的产生[1]。本研究中，采用流式细胞术分析了树突状细胞中CD103的表达，如图2所示，与空白组相比，L9能够显著促进BMDCs中CD103的表达，且高剂量L9组中CD103表达的升高幅度达87.06%，高于阳性对照组。

机体内的DCs有许多不同亚型，其中CD103+DCs是一种重要的调节性DCs，参与调节许多炎症反应。肠黏膜层的CD103+DCs可以通过TGF-β和视黄酸代谢途径促进naive CD4+T细胞向Treg细胞分化[2]。有研究表明，食物过敏小鼠的肠组织淋巴细胞中CD103+DCs细胞比例降低[8]，证实了CD103+DCs在调节机体免疫耐受方面的重要性。益生菌与CD103+DCs相关研究表明，用双歧杆菌灌胃小鼠，可提高小鼠肠道中CD103+DCs分泌IL-10水平，促进Treg细胞的产生，缓解小鼠肠道炎症反应[9]。相似实验表明，益生菌虽然可以促进DCs中IL-10和TGF-β的mRNA表达，但CD103+DCs细胞比例并没有显著变化[4]。

在本研究中，L9不但促进了BMDCs中IL-10和TGF-β的分泌，还促进了CD103的表达，表明L9可以通过提高CD103+DCs细胞数量来参与调节机体的免疫平衡。

2.3 L9 调节CD4+T 细胞向Foxp3+Treg 细胞分化

调节性DCs可以促进机体内Foxp3+Treg细胞分化，参与机体的免疫调节。为了更全面地研究L9对DCs功能的促进作用，采用L9诱导后的BMDCs与小鼠CD4+T 细胞联合培养，使用流式细胞术分析了CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例。由图3可以看出，与空白组相比，L9组小鼠CD4+淋巴细胞中CD25＋－Foxp3+Treg细胞比例显著增加，且以高剂量L9组增加幅度最大。结果表明，L9刺激后的BMDCs能够促进过敏小鼠CD4+T 细胞中Foxp3的表达，可以调节机体T淋巴细胞平衡。

图3 L9 对小鼠CD4+T 细胞中CD25+ Foxp3+Treg 细胞数量的影响

Foxp3+Treg细胞可以调节T细胞平衡，在建立机体免疫耐受及缓解炎症反应中起到关键性作用。研究表明，益生菌可以提高小鼠体内Foxp3+Treg细胞的数量，缓解炎症反应[4,10]。机体内naïve CD4+T细胞向Foxp3+Treg细胞分化与CD103+DCs功能有关[2]。本研究结果表明，L9诱导的BMDCs提高CD4+T中Foxp3+Treg细胞比例，证明L9可以通过诱导DCs功能，参与Foxp3+Treg细胞介导的免疫调节作用。

3 结论

以骨髓源树突状细胞（BMDCs）为模型，研究了L9对DCs功能的影响。研究表明，L9促进BMDCs分泌调节性细胞因子（IL-10和TGF-β），提高CD103表达，可以诱导Foxp3+Treg细胞分化。由此可见，L9可以通过调节DCs分泌调节性细胞因子，诱导机体偏向Foxp3+Treg型细胞免疫应答。本研究结果揭示，L9的免疫调节活性与其提高CD103表达有关，但其分子免疫学机制还不是很清楚，有待于进一步研究。

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