菌落直径法和菌丝干重法在优化真姬菇菌种固体斜面培养条件的比较*

孙 磊，程显好，李维焕，欧胜平，杨 涛

（鲁东大学农学院生命科学学院，山东 烟台 264025）

菌落直径法和菌丝干重法在优化真姬菇菌种固体斜面培养条件的比较*

孙 磊，程显好**，李维焕，欧胜平，杨 涛

（鲁东大学农学院生命科学学院，山东 烟台 264025）

为了优化真姬菇菌种培养基配方及培养条件，对表征菌丝生长状况的菌落直径扩散法和菌丝干重法进行了比较，结果菌落直径扩散法和菌丝干重法结果有较大差别，菌落直径扩散法并不能真正反映菌丝的生物量。

真姬菇；菌落直径扩散法；菌丝干重法；生物量

真姬菇，又名玉蕈、蟹味菇，享有“闻则松茸，食则玉蕈”的美誉[1]，是一种营养丰富的食用兼药用的珍稀食用菌[2]，也是目前进入工厂化生产的重要食用菌之一[3]，具有提高人体免疫力，预防衰老，延长寿命等多种功效[4]，广受消费者的喜爱，也是一种极具潜力的生产品种。

菌种质量是真姬菇工厂化生产过程中的关键因素，菌种质量的优劣直接关系到最终产品的产量和品质[5]。因此，为了食用菌产业的健康稳定发展，必须对作为生产源头的菌种的生产条件进行优化。

运用适当的方法优化选出适合真姬菇菌种生长的最适生长条件，有利于降低生产成本，提高菌种质量，从而提高产量。目前，在菌种培养条件优化工作中，固体培养条件下菌丝生长量常用的测定方法为菌落直径扩散法[6－8]，液体培养条件下菌丝生长量测定则多用生物量法（菌丝干重法）[9－10]。固体培养条件下，存在着菌丝难以与培养基分离的问题，所以研究工作中采用菌落直径扩散法较多。但此方法属于间接法，不一定能真实反应菌丝的生长量，采用这种方法获得的结果，容易给生产实践造成困扰。

针对培养基与菌丝难分离的问题，通过平板上铺一层玻璃纸的方式，能防止菌丝在培养基中蔓延，其微小孔径又不影响培养基中的营养成分传输至菌丝，所以可以使菌丝轻易与培养基剥离，便于采用干重法测定生物量。

为比较菌落直径法和生物量法的利弊，本文以真姬菇为供试菌株，比较了菌落直径扩散法和生物量法测定结果的差异，以期为今后的科研、生产测定方法的选择提供依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 供试菌株

真姬菇菌种由鲁东大学菌物科学技术研究院菌种室保存。

1.1.2 培养基

GPY固体培养基（1 L）：葡萄糖20 g、蛋白胨6 g、酵母膏10 g、琼脂10 g，pH 6.0。

PDA固体培养基（1 L）：马铃薯200 g（煮汁）、葡萄糖20 g、琼脂10 g，pH 6.0。

GPC固体培养基（1 L）：葡萄糖20 g、蛋白胨6 g、玉米浆10 g、琼脂10 g，pH 6.0。

麦芽汁固体培养基（1 L）：每升麦芽汁（固形物5.0%）中加入琼脂10 g，pH 6.0。

胡萝卜固体培养基（1 L）：胡萝卜200 g（煮汁）、葡萄糖20 g、琼脂10 g，pH 6.0。

麦麸固体培养基（1 L）：麦麸30 g（煮汁）、葡萄糖20 g、K2HPO43 g、MgSO41.5 g、琼脂10 g，pH 6.0。

1.2试验方法

1.2.1 菌种活化

无菌条件下，将保存的真姬菇菌株接种于PDA斜面培养基上，25℃避光培养5 d～7 d，备用。将活化后的斜面菌种接种于平板的正中央，25℃避光培养9 d～10 d，备用。

1.2.2 菌落直径测定法

无菌条件下，将活化后平板培养的菌丝用5 mm打孔器沿着外周打孔，取生长最旺盛的平板菌落边缘菌丝块。在平板上铺一层灭菌玻璃纸，然后将菌块接到6种已铺好玻璃纸的培养基正中央，25℃避光培养，定期测量菌落直径大小，每个平板分别用直尺沿平板底部垂直方向测3次，取平均值，每个实验至少3个重复。

1.2.3 生物量测定法

无菌条件下，将活化后平板培养的菌丝用5 mm打孔器沿着外周打孔，取生长最旺盛的平板菌落边缘菌丝块。在平板上铺一层灭菌玻璃纸，然后将菌块接到6种已铺好玻璃纸的培养基正中央，25℃避光培养，定期进行测量。每次取每种培养基的3个平板进行测量，将铺在培养基上的玻璃纸揭下来，菌丝仔细刮下，除掉培养基和玻璃纸，菌丝置于干燥箱中60℃烘干至恒重，用电子天平称量其重量。

1.2.4 pH筛选

培养基设置pH值分别为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0六个梯度，25℃时，每个梯度在6种培养基条件下分别培养18个平板，采用菌落直径法和生物量法分别测定不同pH情况下菌丝的生长状况，并进行比较。

1.2.5 温度筛选

培养温度分别设置15℃、20℃、25℃、30℃四个梯度，在pH6.0条件下，每个温度梯度在6种培养基条件下分别培养18个平板，采用菌落直径法和生物量法分别测定不同温度条件下菌丝的生长状况，并进行比较。

1.2.6 培养基筛选

分别采用菌落直径法和菌丝干重法测定菌丝在GPY、PDA、GPC、麦芽汁、胡萝卜、麦麸6种固体培养基条件下的生长状况，并进行比较。

2 结果与分析

2.1两种菌丝生长测定方法比较pH对菌丝生长的影响

比较培养至第12天时不同pH下的的菌丝生长量，结果见表1、表2。

由表1可知，6种培养基中菌丝均在pH6.0的时候有最大生长直径，即生长速度最大，生长速度快慢大致表现为麦芽汁固体培养基＞GPY固体培养基＞PDA固体培养基＞胡萝卜固体培养基＞GPC固体培养基＞麦麸固体培养基。表1中通过对比同一培养基中菌丝在不同pH条件下的生长状况不难看出，除pH4.5之外，其他pH对生长速度最快的麦芽汁固体培养基中菌丝的影响很小。

由表2可知，不同培养基中，菌丝生长所需pH不同，麦麸、GPY和GPC固体培养基中的菌丝生长受pH的影响较大，其余几种培养基中的菌丝生长受pH影响较小，其干重情况表现为GPY固体培养基＞GPC固体培养基＞胡萝卜固体培养基＞PDA固体培养基＞麦麸固体培养基＞麦芽汁固体培养基。其中干重较大的GPY固体培养基和GPC固体培养基中的菌丝在pH6.0时干重最大。

不同pH条件下菌丝生长状况差异分析见表3。

表1 菌落直径法测定的pH对菌丝生长的影响Tab.1 The effect of pH on mycelium growth with the colony diameter diffusion method

表2 生物量法测定的pH对菌丝生长的影响Tab.2 The effect of pH on mycelium growth with dry weight method

表3 不同pH条件下菌丝生长状况差异分析Tab.3 Analysis of mycelium growth status under different pH

由表3可以看出，pH6.0条件下菌丝的生长状况与其他pH条件下的菌丝生长状况相比差异达到极显著水平（p＜0.01），其它pH条件之间虽然有一定差异，但差异没有达到显著水平。说明pH6.0是最适合菌丝生长的pH条件；pH4.5条件下菌丝的生长状况与其他pH条件下的菌丝生长状况差异也达到极显著水平（p＜0.01），但这一条件下的菌丝生长缓慢，说明pH4.5是最不适合菌丝生长的培养条件。

2.2两种菌丝生长测定方法比较温度对菌丝生长的影响

比较培养至第12天时不同温度条件下的的菌丝生长量，结果见表4、表5。

表4 菌落直径法测定的温度对菌丝生长的影响Tab.4 The effect of temperature on mycelium growth with the colony diameter diffusion method

由表4可知，菌丝在4种温度条件下均能生长，除麦芽汁固体培养基之外，其余几种培养基中的菌丝对于温度的需求为25℃＞30℃＞20℃＞15℃，随着温度从低到高的变化，菌丝的生长速度大致呈现先上升后下降的趋势，麦芽汁固体培养基中的菌丝在25℃和30℃条件下生长速度差异不大；15℃条件下菌丝生长缓慢，明显低于其他温度条件下菌丝的生长速度，所以不适合作为菌丝培养的温度。

由表5可知，除麦麸固体培养基之外，其他培养基中菌丝对于温度的需求为25℃＞20℃＞30℃＞15℃，菌丝干重随温度变化也大致呈现先上升后下降的趋势。相对于表4中麦麸培养基中菌丝的生长速度而言，菌丝干重出现这种现象可能与操作误差有关系，也可能是温度适宜造成菌丝的徒长，但菌丝致密程度不够，导致干重降低，具体原因有待进一步研究证明。不同温度中菌丝生长差异的分析见表6。

表5 生物量法测定的温度对菌丝生长的影响Tab.5 The effect of temperature on mycelium growth with dry weight method

表6 不同温度中菌丝生长差异显著性分析Tab.6 Analysis on significant difference of mycelium growth status under different temperature

由表6可以看出，25℃时菌丝生长与其他温度条件下菌丝的生长差异达到极显著水平（p＜0.01），所以，25℃是菌丝生长的最适温度。

2.3两种菌丝生长测定方法比较培养基对菌丝生长的影响

比较培养至第12天时不同培养基条件下的的菌丝生长量，结果见表7。

表7 不同培养基中菌丝生长状况差异显著性分析Tab.7 Analysis on significant difference of mycelium growth status in different culture medium

以菌落直径法表征菌丝生长速度时，菌丝在6种培养基中均能生长（表1），其生长速度快慢表现为：麦芽汁固体培养基＞PDA固体培养基＞GPY固体培养基＞胡萝卜固体培养基＞GPC固体培养基＞麦麸固体培养基。同时由表7可以看出，麦芽汁固体培养基中的菌丝生长速度与其他培养基条件下的菌丝生长速度相比达到极显著的差异（p＜0.01），说明麦芽汁固体培养基和PDA固体培养基是最适培养基；麦麸固体培养基和GPC固体培养基不适宜培养菌丝。

但生物量法的测定结果与菌落直径扩散法的结果不一致（表2），6种培养基中菌丝的干重情况由大到小顺序为：GPY固体培养基＞GPC固体培养基＞胡萝卜固体培养基＞PDA固体培养基＞麦麸固体培养基＞麦芽汁固体培养基，由表7可知，GPY和GPC固体培养基中的菌丝干重与其他固体培养基中的菌丝干重相比达到极显著差异（p＜0.01）；GPY和GPC固体培养基中的菌丝干重间也有显著差异，且通过比较表1中2种培养基中的菌丝在同种培养条件下的生长状况可知，GPY固体培养基中的菌丝生长状况优于GPC固体培养基中的菌丝生长状况。

3 讨论与结论

近年来，随着食用菌产业化的不断发展，生产实践对菌种的质量提出了更高的要求，通过不同方法优化研究菌种培养条件报道很多，以期获得保持菌种最佳生长状态的条件。吴韶菊[6]等运用菌落直径法，以PDA培养基和玉米粉培养基为基本培养基，通过改变碳氮源测定真姬菇的生长状况，研究得出适于真姬菇菌丝体生长的最适培养基为玉米粉20 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、MgSO41 g、KH2PO41 g、蛋白胨1 g；杨梅等[9]对秀珍菇液体发酵条件进行研究，以菌丝体生物量为测定指标，筛选出秀珍菇菌丝体深层培养的最适碳源为玉米粉，最佳发酵条件为pH5.0，接种量10%。

菌种生产中，不仅菌丝生长速度要快，菌丝的活力、产量、抗逆性、颜色等标准更加重要。菌落直径扩散法是依据测量的菌丝蔓延速度作为主要的评价依据，蔓延速度快的培养基条件就被认为是相对适合的培养条件，这种方法培养的菌种能在相对短的时间内长满培养基，但是单凭菌丝的蔓延速度无法真正地反应菌种的生长状况，容易重视菌丝的徒长，对菌种的质量造成误判，所育菌种可能存在产量低、抗性弱等问题，对生产实践造成困扰；生物量法是依据菌丝的最终生物量为评价依据，生长速度相对快、生物量高的培养基条件为适合的培养条件，这种方法培养的菌种以产量高作为主要标准，不单纯追求高的菌丝蔓延速度，更能保证菌种的高活力、强抗性。

以2种菌丝生长测定方法优化真姬菇菌种斜面培养基，其结果在温度和pH方面没有差别，但所选培养基的种类差别很大，菌落直径扩散法中得出最适培养条件为25℃、pH6.0、麦芽汁固体培养基，而生物量法得出的结论为25℃、pH6.0、GPY固体培养基；直径扩散法选出的麦芽汁固体培养基，虽然菌丝生长速度最快，但菌丝稀疏、细弱、颜色暗淡，不适合作为菌种使用，而生物量法选出的GPY固体培养基中的菌丝浓白健壮，菌落丰厚，边缘整齐，且生长速度也相对较快，比较符合作为菌种的标准。

通过对比表1、表2中菌丝的生长速度与生物量的数据发现，菌丝生长速度与生物量之间没有线性相关关系。因此，菌丝蔓延的快，不一定质量好。

本研究结果表明，生物量法比较适合优化真姬菇菌种的培养条件，同时，依据此方法得出的真姬菇菌种的最适培养条件为25℃、pH6.0、GPY固体培养基。

[1]郑宇，林兴生，陈福如.真姬菇生物学特性研究初报[J].食用菌，2001，23（3）：12-13.

[2]颜松.真姬菇液体发酵工艺优化及发酵产物分析[D].福建：福建农林大学，2008：1-81.

[3]张金霞.中国食用菌产业科学与发展[M].北京：中国农业出版社，2009.

[4]刘振伟，史秀娟，马强.真姬菇的特性及其栽培技术[J].中国果菜，2001（4）：15-16.

[5]刘洋.真姬菇菌种质量评价方法的研究[D].南京：南京农业大学，2010：1-61.

[6]吴韶菊.真姬菇母种培养基的筛选研究[J].北方园艺，2010（5）：181-183.

[7]沈淑平，覃江霞.真姬菇母种培养基的筛选试验[J].植物医生，2004，17（2）：24-25.

[8]陈福，李开本，何修金，等.真姬菇生长发育条件研究[J].江西农业大学学报，1999，21（4）：516-518.

[9]杨梅，沈炎芬，石磊，等.秀珍菇深层培养条件及菌丝体氨基酸组分分析[J].食用菌，2007，29（1）：11-12.

[10]王秀艳.Fe2+对金针菇菌丝生长的影响[J].赤峰学院学报，2012，28（9）：156-158.

书讯

《食用菌营养与烹饪》由湖南省食用菌研究所与中国食用菌协会、中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所共同编写，主要包括毒菌类的识别方法、食用菌的选购与贮藏、食用菌的营养与保健作用、食用菌经典菜式等内容，重点介绍39种常见食用菌141个菜品的烹饪方法。烹饪方法结合了多地菜肴的特色，兼顾营养、口味、地域及烧、蒸、煮等各种制作技巧的使用，菜式丰富、搭配合理。内容详实、图片精美，实用性强。

本编辑部现有少量存书，欲购者可直接汇款至中国食用菌杂志编辑部，本书定价29.8元，平邮加邮寄费5元，挂号加邮寄费10元，联系电话0871-65151099。

《中国食用菌》编辑部

Comparison of the Colony Diameter Diffusion Method and Dry Weight Method in Optimizing the Culture Condition of Hypsizygus marmoreus Strain

SUN Lei,CHENG Xian-hao,LI Wei-huan,OU Sheng-ping,YANG Tao
(College of Agricultural,College of Life Science,Ludong University,Yantai 264025,China)

To optimize the culture medium and culture condition of Hypsizygus marmoreus strain,the colony diameter diffusion method and dry weight method were compared.There was a great difference between these two methods.The colony diameter diffusion method can not truly reflect the biomass of mycelium.

Hypsizigus marmoreus;the colony diameter diffusion method;dry weight method;biomass

S646.9

A

1003-8310（2015）03-0028-05

10.13629/j.cnki.53－1054.2015.03.008

山东省现代农业产业技术体系食用菌产业创新团队（SDAIT－11－011－11）。

孙磊（1989－），男，在读硕士研究生，研究方向为菌物生态学。E－mail:734692973@qq.com

**通信作者：程显好（1966－），男，博士，教授，主要从事菌物生态学和食药用真菌产品研发研究。E－mail:chengxianhao@sohu.com

2015－03－15