速激肽受体1基因启动子近端E盒点突变对下游基因调控的影响

陈玲群，王练红，周 金，王 林(怀化市第二人民医院检验科，怀化 48000;湖南医药学院检验系)

速激肽受体(neutokinin receptor，NKR1-3)属于G蛋白偶联跨膜受体家族，主要表达在中枢神经细胞、骨髓基质和乳腺细胞等组织［1］，其中NK1R基因转录成两种mRNA，分别翻译成全长型(NK1R-Fl)和截断型(NK1R-Tr)受体，两型受体翻译起始点一样，mRNA前1 520 nt序列相同，二者所不同的是表达产物C端不一样，而C末端在细胞内，不同的C末端直接造成了两类受体截然不同的信号传导通路［2］。NK1R受体基因转录起始点上游调控区存在E盒结构。我们初步对NK1R基因转录起始点上游近段E盒结构进行点突变，通过荧光素酶报告基因载体［3］，研究E盒结构的突变是否会影响下游基因的表达。

1 材料和方法

1.1 材料

胎牛血清(Fetal bovine serum.FBS)与 DMEM/F12培养液购自美国Hyclone公司;胰酶消化液购自北京天润善达生物制品有限公司;Promega限制性核酸内切酶:mluⅠ、HxoⅠ，LB 液体培养基(pH7.4)与动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒(D1700)购自北京索莱宝科技有限公司;Biospin胶回收试剂盒BSC02M1、去内毒素质粒提取试剂盒(QIAGEN)、Roche FuGene转染试剂、双荧光素酶检测试剂盒、PGL4.74 hluc内参质粒购自 Promega公司;PGL3-basic荧光素酶报告基因载体系列;HBL-100、MCF-7细胞系来自湖南医药学院。

1.2 克隆含近端E盒结构启动子

1.2.1 野生型NK1R启动子的克隆 定位近端E盒“CACATG”结构位点，根据近端E盒位置利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0设计引物，扩增含一个近端E盒结构的DNA序列。

HBL-100细胞用含100 ml/L胎牛血清的DMEM，置于37℃、50 ml/L CO2细胞培养箱中培养，提取基因组DNA，作为扩增模板。巢式PCR扩增目的DNA片段，外向引物(nkw1上游引物:CAGGATTCTGGAGCTTCGTAT，nkw1下游引物:CTACCGTTTGAAATGGTCTTG)。扩增程序:94℃预变性120 s，然后以94℃ 30 s，52℃ 复性30 s，68℃ 延伸70 s进行35个循环，68℃ 延伸10 min，4℃保存。以外向扩增产物为模板，用内向引物(NK1R上游引物:CGCCCTCGAGAGTTTCGCGGGCACCTCT，NK1R下游引物:AGCCACGCGTCTGAGCGACAAGCTGCCTA)扩增，具体程序同前，延伸时间设为60 s。对第二轮PCR产物纯化回收，得到NK1R野生型启动子，产物长度为827 bp。

1.2.2 重叠延伸PCR对NK1R启动子近端E盒点突变 将巢式PCR产物纯化回收后作为模板，进行重叠延伸PCR，引入点突变CACAT G→CACAC G。第 一 轮 PCR 用 p1，p2引 物(p1:CGCCCTCGAGAGTTTCGCGGG CACCTCT，p2:CATCGCCCCCACACACGACCGTTTCCCATTG)扩增短片段，p3，p4 引物 (p3:CAATGGGAAACGGTCGTGTGTGGGGGCGATG，p4:CACAACGCGTACCTCTTGTGCAGCCGCTCTA)扩增长片段;完成扩增后，纯化回收。第二轮PCR:把纯化后的长、短片段放到同一个反应管中，相互作为模板和引物，反应4个循环。第三轮PCR:以第二轮全长PCR产物为模板进行扩增，用p1，p4引物，即扩增出带有点突变的启动子。将PCR最后产物电泳，纯化回收。

1.2.3 野生型和突变型荧光素酶报告基因构建把纯化的野生型和突变型NK1R启动子PCR产物以及PGL3-basic分别进行mluⅠ和HxoⅠ双酶切，酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化回收。然后用T4 Ligase对PGL3-basic分别与NK1R野生型和突变型启动子进行连接，连接反应体系为:T4 Ligase(Trans)3.5 μl，NK1R 8 μl，ddH2O 7 μl，5 ×buffer(Trans)5 μl，PGL3-basic 6 μl，16 ℃ 连接过夜，另设PGL3-basic自连反应体系，确保酶切后的PGL3-basic不自连。转化感受态细菌DH5α，用灭菌玻璃棒把连接产物转化的菌液均匀涂布到100 μg/ml氨苄青霉素LB固体培养基上，37℃培养12-16 h。每个平板挑取4个菌落，分别置入100 μg/ml氨苄青霉素LB液体培养基培养过夜。每支LB菌液取1 ml送北京奥科生物公司测序，序列比对合格的菌落再进行培养。提取去内毒素质粒。用测序和XhoⅠ/mluⅠ 双酶切电泳对启动子片段进行鉴定，测得浓度为 360 μg/ml，A260/280=1.847。

1.3 双荧光素酶检测试剂检测启动子活性

复苏MCF-7乳腺癌细胞，为了确保细胞良好状态接受转染，从复苏到细胞转染至少传至两代。设定MCF-7组，MCF-7-NK1R野生组，MCF-7-NK1R突变组;质粒为 PGL3-basic-NK1R+PGL4.74 hluc，PGL4.74 hluc作为内参加入到所有试验组，PGL3-basic空载体转染 MCF-7作为对照，PGL3-basic-NK1R野生型转染野生组，PGL3-basic-NK1R突变型转染突变组。把消化后的细胞转移至96孔板，每组5孔，细胞培养至70%-80%融合时即开始转染。转染前2 h，把每孔培养基调节至100 μl。FuGene Reagent和质粒DNA平衡至室温，用前混匀。吸取85 μl Opti-MEM1 Reduced Serum Medium 至各个稀释孔中，按质粒(μg):FuGene Reagent(μl)=2∶7 的比例配制质粒DNA(包括内参质粒)和FuGene Reagent混合物，室温放置15 min。每孔加7 μl FuGene Reagent和质粒DNA混合物，培养板水平充分混匀后置入细胞培养箱培养。转染后培养30 h检测荧光素酶表达情况。检测试剂Dual-Glo Luciferase Buffer与Luciferase Substrate混匀;Stop Glo Substrate与Stop Glo Buffer按1∶100混合混匀。检测前把待测细胞孔内的培养基调至75 μl，平衡至室温，每孔加 75 μl Dual-Glo Luciferase Buffer＆ Luciferase Substrate混合液，混匀后室温静置10 min，检测OD值，作为数据1。每孔再加75 μl Stop Glo Substrate＆Stop Glo Buffer混合液，混匀后室温静置10 min，检测OD值，作为数据2。数据整理按以下公式(Rate表示相对荧光素酶活性):

1.4 数据分析

采用SPSS 15.0软件进行统计学分析，比率值采用非参数检验(Mann-Whitney U)，以P＜0.05为有差异统计学意义。

2 结果

2.1 各类荧光素酶报告基因载体酶切电泳和测序图

图1 NK1R巢式PCR扩增启动子电泳图Figure 1 NK1R promoters amplified by nested PCR

各类PCR扩增产物和质粒通过1%琼脂糖凝胶电泳，各条带均出现在目的位置(见图1);各类载体及PCR纯化产物A260/280均在1.8-2.0。野生型和突变型荧光素酶报告基因载体构建完成后，经测序和酶切鉴定显示两类载体构建成功(见图2 -4)。

2.2 荧光素酶活性检测

PGL3野生型组和PGL3突变型组荧光素酶相对活性明显高于PGL3-basic组(P＜0.01);PGL3突变型组低于PGL3野生型组(P＜0.05，见表1)。结果 说明克隆的NK1R基因部分启动子DNA序列能够启动下游基因表达，E-box序列点突变能够影响该DNA序列的转录活性。

图2 NK1R荧光素酶报告基因载体酶切Figure 2 NK1R luciferase report gene vectors digested by restriction enzyme

图3 PGL3-basic-NK1R 826 bp荧光素酶报告基因载体部分序列Figure 3 The partial sequences of PGL3-basic-NK1R 826 bp luciferase report gene vector

图4 点突变型NK1R荧光素酶报告基因载体测序Figure 4 The partial sequences of pGL3-basic-NK1R promoter point-mutated luciferase report gene vector

表1 野生型和突变型报告基因载体相对荧光素酶活性(±s)Table 1 The luciferase activity of wild and mutated report gene vectors(±s)

表1 野生型和突变型报告基因载体相对荧光素酶活性(±s)Table 1 The luciferase activity of wild and mutated report gene vectors(±s)

组别 相对荧光素活性PGL3空载组0.38 ±0.05 PGL3 野生型组 0.75 ±0.05 PGL3突变型组0.60 ±0.07

3 讨论

在正常乳腺细胞膜提取物中，NK1R-Tr水平非常低，有时甚至难以检出，有研究表明，乳腺癌细胞P物质过量表达，导致了NK1R-Tr表达水平也上调，具体的中间过程，有可能P物质直接作用，也有可能P物质通过其他细胞因子激活NK1R-Fl表达，总之P物质和NK1R，尤其是NK1R-Tr在乳腺上皮细胞共同高水平表达，暗示细胞恶变［4-6］。通过对NK1R转录起始上游序列的分析，发现有几处E盒结构，鉴于转录起始点上游第一和第二个E盒相距较远，我们选择性克隆了只含第一个E盒结构的DNA序列，片段大小为826 bp，通过对E盒第5个碱基T置换为C，我们发现含突变E盒的DNA序列对下游荧光素酶基因的转录活性有所下降，我们的研究揭示近段第一个E盒结构的完整对下游基因的转录活性有一定的影响。

［1］岳发贵，孙薇，梁迪，等.神经激肽1受体拮抗剂研究进展［J］.国际药学研究杂志，2010，37(3):203-208.

［2］周云丽，姚智.P物质及其受体的研究进展［J］.国际免疫学杂志，2011，34(3):190-194.

［3］薛秀花，黄晨西.荧光素酶基因的研究进展［J］.生物学通报，2013，48(9):1-4.

［4］周云丽，付正，李金萍，等.P物质及其受体在乳腺癌中的表达和临床意义［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2014，34(11):874-880.

［5］Singh D，Joshi DD，Hameed M，et al.Increased expression of preprotachykinin-I and neurokinin receptors in human breast cancer cells:Implications for bone marrow metastasis［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(1):388-393.

［6］Bandari PS，Qian J，Oh HS，et al.Crosstalk between neurokinin receptors is relevant to hematopoietic regulation:cloning and characterization of neurokinin-2 promoter［J］.J Neuroimmunol，2003，138(1-2):65-75.