食品添加剂对两种乳酸菌的抑菌作用

黄宝莹，佘之蕴，苏妙仪，罗永潮，黄玲玲

（广东产品质量监督检验研究院广东顺德528000）

0 引言

酸奶含有丰富的营养成分，如蛋白质、维生素、矿物质、乳酸等[1]。酸奶除了富含营养物质，还有多种保健功能，如减轻乳糖不耐症、调整肠道菌群的生态平衡[2]、降低胆固醇[3]、降血压、提高免疫力等[4]。酸奶的营养物质和保健功能取决于乳酸菌的品种和活力。联合国粮农组织、世界卫生组织和国际乳品联合会（FAO、WHO/IDF）及GB 19302-2010《食品安全国家标准发酵乳》中均有规定，酸奶成品中必须含有大量的、相应的活性乳酸菌[5]。上述国标允许在风味发酵乳中添加食品添加剂，本文主要研究多种香精、色素等食品添加剂对德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌的抑菌活力和最小抑菌浓度，探讨其对乳酸菌的抑菌作用，以期对酸奶的生产控制提供理论依据。

1 实验

1.1 材料

嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus，St）FSCC 225005；德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus bulgari⁃cus，Lb）CICC 6045。

培养基为MRS琼脂。

添加剂如表1所示。

1.2 仪器和设备

AC2-6S1生物安全柜，玻璃热珠灭菌器，Easy⁃mix拍击式均质器，GHP-9160隔水式恒温培养箱，麦氏比浊仪，牛津杯（内径6.0mm±0.1mm，外径7.8mm±0.1mm，高10.0mm±0.1mm）。

2 方法

2.1 牛津杯法[6-7]

2.1.1 指示菌悬液的制备

菌株划线于MRS琼脂，36℃±1℃厌氧培养48 h活化，培养至生长良好。取新鲜培养的菌株，用麦氏比浊仪制备成2.40～2.60麦氏比浊度（约106mL-1）菌悬液，立即用于抑菌实验。

2.1.2 抑菌液的配制

粉末状添加剂：称取一定质量的添加剂，液体添加剂：吸取一定体积的添加剂，用无菌水溶解，定容至100mL，摇匀，制成一定浓度的抑菌液，4℃保存备用，使用前摇匀。粉末状添加剂以10.000 g/100 mL为初始质量浓度，按二倍稀释法制成5.000，2.500，1.250，0.625，0.313，0.156，0.078 g（每100 mL中）系列质量浓度；液体状添加剂以原液100.000%为初始体积分数，按二倍稀释法制成50.000%，25.000%，12.500%，6.250%，3.125%，1.563%，0.781%，0.391%系列体积分数。

2.1.3 检测平板的制备

每个平板加入20 mL的MRS琼脂，凝固后待水份干燥，取0.2 mL菌悬液在平板上均匀涂布，以平板无可见水滴为准，立刻进行抑菌实验。

表1 食品添加剂

2.1.4 抑菌圈测定

以无菌水为空白对照，每个平板均匀放置3～4个牛津杯，将200 L抑菌液加入到牛津杯中，36℃±1℃下厌氧培养48 h。观察牛津杯底周围有无抑菌圈，每次试验至少作3次重复，测量抑菌圈直径，取平均值。

2.1.5 最小抑菌浓度（MIC）测定

先以初始质量浓度（或体积分数）的添加剂溶液做初筛实验，根据初筛结果，挑选出有抑菌作用的添加剂，用牛津杯法测定其MIC，能产生抑菌圈的最小的质量浓度（或体积分数）定为MIC。其确定标准为：在该质量浓度（或体积分数）下抑菌圈直径大于或等于8.0 mm。

3 结果与讨论

3.1 添加剂的初筛结果

采用牛津杯法测试37种添加剂对两种指示菌的抑制作用，初步筛选有抑菌效果的添加剂，其结果如表2所示。

表2 添加剂的初步筛选结果 mm

采用牛津杯法进行添加剂的筛选，牛津杯中的试剂缓慢向四周扩散，假若添加剂对指示菌有抑菌效果，在杯底周围与培养基接触面就出现抑制圈。抑菌圈的大小就代表添加剂抑菌力的高低。由表2可以看出，7种色素和4种甜味剂，除了甜蜜素对嗜热链球菌产生了抑菌作用，其他均不产生抑菌圈，表明其对乳酸菌无抑菌作用。24种甜味香精中有21种对乳酸菌产生了大小不同的抑菌圈，同一风味不同厂家的香精对乳酸菌的抑菌效果存在较大差异。两种乳酸菌对柠檬酸和苹果酸均十分敏感，都产生了较大的抑菌圈。对乳酸菌的抑菌作用由强到弱分别为酸度调节剂、香精、甜味剂、色素。

3.2 色素对乳酸菌的抑制作用

7种色素均为粉末状添加剂，其初筛质量浓度为10.000 g/100 mL。由表2可知，7种色素均没有产生抑菌圈。此质量浓度下，色素已是过饱和溶液，说明7种色素对Lb和St无抑菌作用。实验过程中，色素均随着牛津杯由里向外均匀扩散，MRS培养基也随之染上相应颜色，但乳酸菌在其表面生长良好。根据GB 19302-2010《食品安全国家标准 发酵乳》和GB 2760-2011《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》，发酵乳中允许使用柠檬黄、日落黄、胭脂红、亮蓝色素，前三者最大使用量为0.05 g/kg，亮蓝为0.025 g/kg，栀子黄、苋菜红在食品中的最大使用量一般为0.3g/kg，姜黄按生产需要适量使用，而实际应用中，出于生产需要和成本考量，实际使用量远远低于最大使用量。说明在使用范围内，7种色素对乳酸菌无抑制作用。

3.3 香精对乳酸菌的抑制作用

24种甜味香精的MIC测定结果如表3所示。

表3 香精对乳酸菌的MIC

由表3可以看出，24种甜味香精中，有21种对两种乳酸菌产生了不同程度的抑制作用。13，18，19，23，24，26这6种香精对Lb的抑菌作用较强；13，18，19，20，23，25，26，29，30这9种香精对St的抑菌作用较强。MIC越小，说明其抑菌效果越强，对于Lb，MIC：18=19=26＜13=23＜30。对于St，MIC：18=19=30＜13=20=26＜23=25=29。食用香精在食品中是按生产需要适量添加，一般添加量在0.01%～0.5%之间。两种乳酸菌的MIC均低至1.563%，接近于实际添加量，说明这几种香精在低浓度下对乳酸菌有明显的抑制作用，可能会影响发酵乳发酵过程或保存期间乳酸菌的生长繁殖和生物活性。

不同香精配方成分差异很大，相同风味的香精，由于需求不同，其配方也不尽相同。香精是由各种酸、醇、醛、酮、酯类等组成的混合物，一般含有二、三十种化学成分。天然香精或人工香精可能含有抑制乳酸菌活性的物质，具体机理尚不清楚。表3中挑选了5种不同厂家生产的草莓香精，其中4种都对乳酸菌产生了明显的抑菌作用。张丹[8]等用气质法分析草毒香精中成分，共鉴定出29种化学成分，其中乙醇占总质量分数的26.979%，丙二醇占66.165%，挥发性成分中乙基麦芽酚占1.979%，叶醇占1.272%。草莓香精的抑菌效果可能源自其主要组成成分。

3.4 其他添加剂对乳酸菌的抑制作用

4种甜味剂、2种酸度调节剂的MIC实验结果如表4所示。

由表4可以看出，甜味剂在10.000 g/100mL质量浓度下对两种乳酸菌基本无抑菌作用。根据GB 19302-2010和GB 2760-2011，发酵乳中允许使用安赛蜜和三氯蔗糖，其最大使用量分别为0.35 g/kg和0.3 g/kg（质量分数）。实验结果表明其在使用范围对乳酸菌无抑菌作用。

表4 其他添加剂对乳酸菌的MIC g/100mL

两种酸度调节剂对乳酸菌均产生明显的抑菌作用。St比Lb对酸更敏感。乳酸菌是一类以乳酸为唯一或主要代谢产物的细菌，故它们对酸性环境比较适应。乳杆菌属的最适pH值为5.5～6.2，最低生长pH值为4.5。链球菌属生长pH值范围较广，对酸较不敏感。但当乳酸菌接种到初始pH偏离最适pH较远的培养条件下时，生长速度很低。10.000%一水柠檬酸的pH值为1.69，在此酸性条件下，各种乳酸菌的生长受到严重抑制，随着一水柠檬酸浓度稀释，pH值逐渐上升，0.078%一水柠檬酸的pH值为2.96，此pH值仍低于乳酸菌最适pH值，但已无抑菌圈产生。当介质pH值在2.96时，菌体内pH值可能高于此值，故其新陈代谢没有收到抑制。

4 结束语

7种色素在初筛浓度下，对Lb和St均无抑制作用。多种甜味香精对乳酸菌产生明显的抑制作用，不同菌株对不同香精敏感性不同，同一风味不同厂家的香精，对同一菌株的抑菌效果也存在差异。这可能与其化学成分和组成差别有关。其中18草莓香精、19草莓香精、26特浓草莓香精对Lb的抑菌作用最强，MIC均为1.563%；18、19、30酸奶香精对St的抑菌作用最强，MIC均为3.125%。

两种乳酸菌对4种常用甜味剂不敏感。DL-苹果酸、一水柠檬酸在食品中常用作酸度调节剂或防腐剂，两种乳酸菌对其十分敏感。其对Lb的MIC均为0.313%，对St的MIC均为0.156%，St对酸的耐受性更差。

抑菌试验结果表明，酸度调节剂对乳酸菌的抑菌力最高，香精其次，色素和甜味剂基本无抑菌力。添加剂对乳酸菌的抑菌机理有待于进一步的研究和探讨。实验结果表明多种添加剂对乳酸菌产生抑菌作用，可能对酸奶发酵过程及保质期间活乳酸菌数量产生影响。

[1]李银花,刘德玲.发酵乳的营养与保健作用[J].现代食品科技,2006,03:299-300.

[2]GONZALEZ N J,ADHIKARI K,SANCHO-MADRIZ M F.Sen⁃sory characteristics of peach-avored yogurt drinks containing prebiot⁃ics and synbiotics[J].LWT-Food Science and Technology,2011,44(1):158-163.

[3]JEUN J,KIM S,CHO S,et al.Hypocholesterolemic effects of Lactoba⁃cillus plantarum KCTC3928 by increased bile acid excretion in C57BL/6 mice[J].Nutrition,2010,26(3):321-330.

[4]朱永胜,刘小杰.酸奶功能特性的研究进展[J].乳业科学与技术,2013,02:30-33.

[5]中华人民共和国卫生部.GB 19302—2010食品安全国家标准发酵乳[S].北京:中国标准出版社,2010.

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[8]张丹,曾玉花.气质法分析草莓香精中成分[J].中国卫生产业,2012,29:6-7.