嗜冷菌对UHT乳品质负面影响研究

姜一铭，韩建春

（东北农业大学食品学院，哈尔滨150030）

0 引言

嗜冷菌：0～7℃下能够生长，并在7～10 d内产生可见菌落的微生物[1]。当原料奶在3～5℃储存一段时间再加工时，嗜冷菌产生的胞外蛋白酶和脂肪酶的几率加大，使得U H T奶产生劣变，导致风味发生变异，最终缩短产品保质期。在140℃灭菌5 s，蛋白酶和脂肪酶的残留量也会达到30%以上，导致苦味、凝块，腐烂味和酵母味。在长期贮存后会使牛奶变苦Law等人[2]得出结论，当乳在灭菌前接种的假单胞菌的数量达到5.0×107mL-1和8.0×106mL-1，灭菌乳在20℃的贮存条件下分别在12天和9个星期后出现胶凝现象[3]。本研究是通过控制原料奶中的嗜冷菌数，测定蛋白酶和脂肪酶活力，明确引起生鲜乳变质的嗜冷菌的生物学特性，研究其生长代谢规律以便有效对其进行控制。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 实验设备

微生物常规检验设备，生化培养箱（LRH-250），立式蒸汽压力灭菌器（LDZX-40BI），实验室水纯化系统，电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9245A），紫外分光光度计（UV-3802S），酸度计（DELTA320）。

1.1.2 菌株

标准菌株：门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）A.S1086 和藤黄微球菌（Micrococcus luteus）ATCC 10028由东北农业大学食品学院提供。

自分离菌株及来源：选择哈尔滨市周边的6个牧场，从2013年9月份到2014年6月份，平均每15 d左右取一次奶样，每天分早、中、晚三次釆样。着重对牧场原料乳的菌落总数、嗜冷菌数进行检测和分析。

1.1.3 培养基

选择乳平板计数琼脂（MPC琼脂milk plate count agar）对牧场采集的原料乳进行嗜冷菌的分离和培养。所用的稀释液为蛋白胨-盐溶液。

1.2 方法

整个检验过程和检测方法参照中华人民共和国农业行业标准—《乳与乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜热需氧芽孢数的测定》（NY/T 1331-2007）。

1.2.1 菌株的分离和培养

采用稀释倾注平板法与平板划线分离结合的方法，分离纯化原料乳中的嗜冷菌。单菌落分离纯化数次后，结合革兰氏染色进行嗜冷菌筛选[5]。将获得的单个菌落在营养琼脂（NA）上7℃培养5 d，扩大培养，观察菌落特征，同时进行革兰氏染色观察和观察细菌动力。将菌株于15℃培养7 d，用紫外光源（253.7 nm型）观察荧光色素产生情况。将各菌种进行需氧性试验，同时置于厌氧罐内培养和空气中培养，30℃培养24 h后观察生长情况。

将经涂片染色镜检确定为纯培养物后的菌株制备[6，7]，进行分离菌株的生理生化试验[8，9]，结合梅里埃生化鉴定套装对分离菌株进行鉴定。并选取部分有代表性的菌株进行16 S rRNA序列分析，为确定菌种的分类学地位提供依据，从遗传学角度对菌株进行确证。

1.2.2 人为污染后UHT乳的加工

将本试验中自分离出铜绿假单胞菌和藤黄微球菌混合培养，进行适当稀释后计数，然后人为污染灭菌乳，灌装后进行UHT乳生产，并对其菌落总数和嗜冷菌数进行计数。分析不同浓度的嗜冷菌对UHT乳货架期的影响。

（1）人为污染

将嗜冷菌菌液稀释成不同的浓度，一共25组原料奶试验样品。再将准备好的嗜冷菌液按要求添加量加入各处理组的原料乳样中，迅速将配制好的乳样于4℃冷藏20 h（还原生鲜奶从收购到进入乳品厂进行生产的时间，这期间嗜冷菌会代谢产生一些酶类），冷藏后对这25组样品进行菌落总数和嗜冷菌数的计数，然后这25组样品用于生产UHT乳。

（2）UHT乳的加工

调配好的25组原料乳样（冷藏于4℃冰箱），依次进行UHT处理（135℃、4 s）无菌灌装（每组灌装200 mL 40瓶），将UHT乳样置于不同温度下贮藏。每周2次测定各项指标（测试频次依据试验后期视具体情况而确定），预测产品的货架期。

1.2.3 保温实验

分别取各组6瓶UHT乳样于37℃保温7 d，并于第3天、第7天取样进行酒精试验、煮沸试验和感官评定，有絮状物者定义为阳性，用“+”表示，反之为阴性，用“-”表示。

1.2.4 货架期的判定

以UHT乳样品的感官评分为辅助指标，煮沸试验、酒精试验作为最终判定产品货架期的主要指标。

（1）煮沸试验，取乳样10 mL于试管中，置沸水浴中加热5 min后观察，不得有凝块或絮片状物产生，否则表示乳不新鲜，而且其酸度大于26°T。

（2）酒精试验，在试管内用等量的中性酒精和牛乳混合（一般用1～2 mL等量混合），在20℃下检测奶样，振摇后不出现絮片的牛乳，表明其酸度低于18°T，此乳为新鲜乳，如出现絮片，则表明酸度高于18°T，此乳为次鲜或变质乳。

1.2.5 感官指标的检测

针对性的对UHT处理后的牛乳进行不同程度的嗜冷菌的污染，放置不同的时间。对牛乳的感官指标进行评定，以苦味值作为检测指标，并通过失稳值对产品状态进行评价。计算公式如下：

苦味值（‰）=50%以上的评定人员确定的苦味样品数/样品总量×1000；

失稳值（%）=苦味产品中出现明显的意味、变色或凝胶等状态的产品数/苦味产品总量×100；

酶活力：在上述条件下，以每分钟分解底物（橄榄油）释放出μmol游离脂肪酸所需要的酶量定义为：一个酶活力国际单位（IU），以IU/mL表示。检测蛋白酶活性（采用Folin-酚试剂法）、脂肪酶活性（按QB/T1803-93A4方法）[10]。

培养液pH值对产酶的影响：分别设定不同pH值的培养液初始浓度，进行产酶试验，定期取样测定其中的酶活力。

IU/mL={[样品NaOH的消耗量（mol）－空白NaOH的消耗量（mol）]×106}/[10（min）×1（mL）]。

培养温度对产酶的影响：分别在5，20，30℃各个条件下培养目标菌种，定期取样测定其中的酶活力。

2 结果与讨论

2.1 自分离菌株的分离和纯化

依据农业部的标准，在低温环境下对原料乳中的嗜冷菌进行筛选、分离，挑取菌落形态有差异的菌落进行进一步分析。分离出10株能适应低温条件的菌株形态，考虑将其作为目的菌株，进行生化鉴定。低温筛选的菌落特征如表2所示。

表2 低温筛选的菌落特征

根据自分离菌株的生理生化特征，将其归纳为以下几个属。

菌株编号：NO.4，6，8，9，10为假单胞菌属（Aeromonas），大小（0.5-1）～（1.5-4）μm。专性需氧，平板划线培养3 d后菌落呈扁平的圆形，菌落透明，表面光滑有光泽，边缘整齐，稍有隆起、温润、呈白色。大多数菌的适温为30℃。普遍存在于土壤、淡水、海水中。端生鞭毛，能运动。

菌株编号：NO.1，3，7为微球菌属（Lactococcus），直径0.5～2.0 μm，成对、四联或成簇出现，但不成链。兼性厌氧，罕见运动，无荚膜，无芽胞，菌落表面光滑，稍突起，奶油白色。可在-4～24℃生长，最适生长温度为25～37℃。最适pH=7。最初出现在脊椎动物皮肤和土壤，但从食品和空气中也常常能分离到。

菌株编号：NO.2，5为产碱杆菌属（Flavobacterium），常成单、双或成链状排列，周生鞭毛，无芽胞，不运动，多数菌株无荚膜。大小1.5～4.2 μm，专性需氧，可在3～41℃生长，最适生长温度25～37℃，在胰蛋白琼脂培养基上菌落圆形，边缘整齐，有光泽、湿润、丰满。最适pH值为5～7。

2.2 菌落总数对UHT乳货架期的影响

各个牧场的菌落总数各不相同，最高的约4.2×103mL-1，最低的2.0×103mL-1（数据略）。

原料乳的细菌总数和嗜冷菌的含量对UHT乳货架期有重要的影响，由于嗜冷菌的污染造成UHT乳品质劣变的状况不容忽视。当菌落总数和嗜冷菌含量很高时，UHT乳的货架期最短，菌落总数为3.7×106mL-1，嗜冷菌数为2.9×106mL-1商品的货架期仅42 d，货架期小于50 d的实验样品，两项指标中会有一项居高不下。随着嗜冷菌含量下降一个数量级，商品的货架期均延长至60 d以上，原料乳中嗜冷菌的数量或蛋白酶、脂肪酶的活性与对应生产的产品的货架期呈负相关。表3为菌落总数和嗜冷菌数对UHT乳货架期的影响。

表3 菌落数对UHT乳货架期的影响

2.3 人为污染后嗜冷菌对产品苦味值的影响

人为污染后灌装，进行UHT乳生产，分析嗜冷菌和其代谢产生的耐热酶对UHT乳货架期的影响，通过控制原料奶中嗜冷菌数、测定蛋白酶和脂肪酶活力对产品品质进行综合判断，建立酶活力与UHT奶品质的相关性比单一研究嗜冷菌与产品品质的关系更直接有效。图1为嗜冷菌污染对产品苦味值的影响。

图1 嗜冷菌污染与产品苦味值之间的关系

由图1可以看出，产品发生劣变与嗜冷菌受污染程度呈正相关，当嗜冷菌污染程度由低到高，产品的苦味值大大增加，贮存时间越长差异越明显。这在存放的前三个月内变化不明显，随着存放时间的延长，污染数量高的样品苦味值开始发生变化，当贮存时间达到8个月时，嗜冷菌污染数量为1 000 mL-1和10 000 mL-1的样品的苦味值变化不十分明显，而嗜冷菌污染数量为100 000 mL-1的样品的苦味值已经达到2%以上，两者相差将近10倍。原料乳污染嗜冷菌程度的大小对UHT奶的品质，从存放5个月后对样品的影响更为显著，所以货架期5个月是控制产品品质的一个关键点，因此控制嗜冷菌数对UHT奶的品质至关重要。

2.4 脂肪酶和蛋白酶对UHT乳苦味值的影响

通过测定嗜冷菌代谢产生的酶的活力，分析酶活力和产品发生劣变的关系。由图2和图3可以看出，酶活力对产品苦味值有一定的影响。消毒处理之前蛋白酶和脂肪酶活力强的UHT奶样品在长期保存时，出现苦味的几率大大增加，说明牛乳即使经过UHT处理，蛋白酶和脂肪酶的活性还有一定残留，造成蛋白与脂肪在贮存过程中被酶水解，导致苦味的产生。

图2 脂肪酶活力对UHT乳制品苦味值的影响

图3 蛋白酶活力对UHT奶苦昧值的影响

运用SAS统计软件的方差分析功能，对嗜冷菌数、蛋白酶和脂肪酶活力这三种因素对存放8个月内的UHT奶的苦味值的影响进行差异显著性多种比较，结果如表4所示。这三种因素对苦味值影响的结果是显著不同的。多重均值测验结果说明，随着嗜冷菌数的升高，苦味值增加，在嗜冷菌数为1 000 mL-1和10 000 mL-1时，标准偏差均小于0.2，说明随着储存时间的延长，该浓度下的嗜冷菌数对产品苦味值的影响差异不显著（P＞0.05），但当嗜冷菌数达到100 000 CFU/ml时，对产品苦味值的影响差异显著（P＜0.05）。脂肪酶活力达到10U/mL，对产品苦味值的影响差异显著（P＜0.05），而在2 U/mL和5 U/mL浓度下，对产品苦味值的影响差异不显著（P＞0.05）。蛋白酶活力在5 U/mL时，对产品苦味值的影响差异不显著（p＞0.05），当浓度提高到15 U/mL和25 U/mL时，对产品苦味值的影响差异显著（P＜0.05）。

表4 不同因素对产品存放8个月后产品苦味值的影响

见表5，苦味的产生主要是由酶类水解脂肪和蛋白质形成的。随着苦味值的增加，组织状态也发生变化，且在苦味值较大时，这种现象更为明显。试验中发现产品即使没有苦味时，组织状态也可能出现变化，如形成凝胶、变粘稠、产生异味等。因此在UHT奶贮存过程中，蛋白酶与脂肪酶对产品的品质影响比较显著。由于嗜冷菌的污染造成UHT奶品质劣变的状况不容忽视。原料乳中嗜冷菌的数量或蛋白酶、脂肪酶的活性与产品长期保存时的品质呈负相关。因此原料奶中嗜冷菌数必须得到控制，通过测定蛋白酶和脂肪酶活力来对原料奶的品质进行分级和评价是很有必要的。

表5 苦味值与产品组织状态的关系

图4 pH值对酶活力的影响

由图4可以看出，各个梯度pH值均有产酶峰值出现，pH值为6.2～7.2时，蛋白酶的活力较高。脂肪酶的最适pH值与蛋白酶相比略向碱性条件偏移，但pH 6.3时，仍然保留着50%以上的最大酶活力，因此，原料乳的贮存pH值对蛋白酶和脂肪酶活性的发挥有促进，这将对UHT奶的长期贮存带来不利影响。

各个温度下培养均有产酶峰值出现，见图5，原料奶的贮存温度对蛋白酶活力的影响比较大，即使在3～5℃的低温条件下，蛋白酶仍具有一定的活性，脂肪酶具有约50%的酶活力。蛋白酶的活性比较高出现在25～30℃。随着温度的增高，酶活性迅速降低。由于脂肪酶在常温下活性发挥的更好，因此常温保存更有利于脂肪酶发挥活性，因此可以通过杀菌等热处理方式降低酶的活性。

图5 温度对酶活力的影响

3 结果与讨论

（1）从对6个农场的原料乳的10个月的监测结果显示，嗜冷菌的平均值为3.2×103mL-1，略高于嗜冷菌的控制目标值1×103mL-1，所以各个牧场在对嗜冷菌的控制上均存在一定的问题。

（2）季节变化对嗜冷菌数的控制影响较大，气温较高的月份嗜冷菌数明显下降，气温较低时嗜冷菌数较高，推断嗜冷菌的生长与气温有一定关系。内部管理水平较高，且自动化程度较高的牧场，在温度较高的月份嗜冷菌的数量低于目标控制值1×103mL-1，说明嗜冷菌的污染与环境有一定的关系。

（3）分离出的嗜冷菌在生长情况良好时形态各异，以革兰氏阴性菌居多，由此推测与肠道菌有一定的联系，所以控制一定数量的肠杆菌科细菌对设计有效的冷藏期限和对加工工艺的评价有很大的价值。

（4）人为污染嗜冷菌后灌装进行UHT乳生产，发现嗜冷菌的原始数量或蛋白酶、脂肪酶的活性与产品长期保存时的品质呈负相关。

（5）UHT处理牛乳后，残留的蛋白酶和脂肪酶会将乳中的蛋白和脂肪水解，产品发生劣变，苦味值也随之增加。

（6）原料乳的贮存pH值对蛋白酶和脂肪酶活性的发挥有促进，这将对UHT奶的长期贮存带来不利影响。

嗜冷菌污染是现代乳制品加工过程中比较常见的问题，应尽量缩短原料乳的贮藏时间，长时间的储藏能产生耐热的酶类从而导致乳及乳制品风味、品质降低，缩短保质期，从而影响产品的质量及加工过程的顺利进行。因此，可以通过适当延长杀菌时间、或采用适当的前置热处理等手段来最大程度的灭活酶，以确保产品的最终品质。同时搞好企业质量管理，防止生乳被嗜冷菌污染从而控制生乳中嗜冷菌的数量、控制其蛋白酶和脂酶的分泌；了解蛋白酶和脂酶的特性，从而有针对性的采取相应的措施。这对于提高乳制品品质，延长保质期，具有重要的意义。

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