葛根核桃肽复合饮料发酵工艺的研究

王端，周鸿翔，王晓丹，邱树毅，田娅玲

（贵州大学酿酒与食品工程学院，贵阳550025）

0 引言

葛根是一种营养价值丰富的药食两用植物，其主要有效成分为黄酮类物质，该物质具有解酒、降血脂、维护心脑血管以及增强机体免疫力等多种生理功能，此外葛根中还含有大量的淀粉，一定量的矿物质、微量元素、维生素和多种氨基酸等，具有解表退热、生津、透疹、升阳止泻等功能[1,2]。核桃多肽从生理功能来说，优于氨基酸和蛋白质，不仅能提供人体生长、发育所需的营养物质，还具有调节人体机能等多种生理功能[3]，目前多肽产品的研制备受人们的关注。本研究以葛根和核桃饼粕为主原料，选用乳酸菌作为发酵菌种，再经发酵液与一定比例的多肽粉混合，研制出一种新型的乳酸发酵型葛根核桃肽复合饮料，将原料的保健及营养作用融合在一起的同时，综合了乳酸发酵的怡人香味以及葛根、核桃原有的风味，构成了乳酸发酵型葛根核桃肽饮料的独特风味。该饮料的研制符合新型功能性营养食品的发展方向。

1 实验

1.1 材料与试剂

葛根（市售优质干葛根）；核桃饼粕、核桃脱脂粉（实验室自制）；保加利亚乳杆菌、乳酸乳球菌乳脂亚种；葛根素标准品；蔗糖、白砂糖、黄原胶、羧甲基纤维素钠、藻酸丙二醇酯、蔗糖酯皆为食品级；α-淀粉酶；糖化酶；中性蛋白酶；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器设备

1260高效液相色谱仪，DK-98-ⅡA电热恒温水浴锅，FD-1A-50冷冻干燥机，FA2004N电子天平，BOXUN立式压力蒸汽灭菌器，JJ-CJ无菌超净工作台，ZHWY-111B落地普通型大容量恒温培养振荡器，7DL-40B台式离心机，ATN-300全自动凯氏定氮仪，723N可见分光光度计。

1.3 方法

1.3.1 复合饮料的制备工艺流程

葛根粉→酶解→添加核桃饼粕、蔗糖→灭菌→接种→发酵→离心→发酵液→添加核桃多肽粉→调配→杀菌→成品。

1.3.2 操作要点

（1）葛根淀粉的酶解。90℃水浴30 min后加入液化酶，加入量为40 U/g，调节pH为6.0，在60℃下水浴酶解60 min，然后加入糖化酶，加入量为160 U/g，调节pH值为4.0，在60℃条件下水浴60 min。

（2）多肽粉的制备。由之前研究可知，脱脂核桃粕[4]用中性蛋白酶酶解，经响应面优化后多肽提取率可达0.45 g/g，将该酶解液置于旋转蒸发仪中，60℃下浓缩至原体积的30%左右，冷冻干燥后即得粗制核桃多肽粉。

（3）多肽粉的添加。基于发酵乳饮料对蛋白质含量的要求，并从成本和口感的角度考虑，最终确定在发酵液中添加1.5%多肽质量分数为66%的粗制多肽粉。

（4）调配。为了得到稳定且口感优良的乳酸发酵型葛根核桃肽复合饮料，确定稳定剂的添加量为黄原胶0.11%，羧甲基纤维素钠0.10%，藻酸丙二醇酯0.17%，蔗糖酯0.14%。此外，白砂糖的添加量8%，柠檬酸0.1%，食用香精0.08%。（均为质量分数，下同）

（5）杀菌。将制得的复合饮料于90℃下灭菌10 min，即得最终产品。

1.3.3 葛根核桃复合发酵液的制备

准确称取一定量的葛根粉于三角瓶中，加入液化酶和糖化酶酶解后，按1∶1的原料比加入核桃饼粕，固液比为1:10，搅拌均匀，在85℃下灭菌15 min，冷却到35℃左右按1∶1的比例接入保加利亚乳杆菌和乳酸乳球菌，37℃，120 r/min下培养2 d，离心后进行感官评分并测定其黄酮提取率。

1.3.4 理化指标的测定

蛋白质的测定GB5009.5-2010；脂肪的测定GB/T5009.6-2003；酸度的测定 GB541334-2010；多肽的测定双缩脲法[5]；黄酮的测定HPLC法[6]。

1.3.5 黄酮的测定

以葛根素为标准品，采用HPLC法测定发酵液中黄酮的质量分数。

（1）色谱条件。Agilent1260高效液相色谱仪，采用SB-C18反相色谱柱(内径4.6mm×250mm，粒径5 μm)，检测器波长250 nm，柱温30℃，分析时间10.2 min，流速0.5 mL/min，进样量10 μL，流动相甲醇∶水=30∶70。

（2）标准曲线的制备。准确称取于80℃烘干至恒重的葛根素标准品5.0 mg，用质量分数为25%甲醇溶解，定容至25 mL，配制成质量浓度为200 mg/L的标准溶液。分别吸取1，2，3，4，5 mL标准溶液至10 mL容量瓶，用25%甲醇定容，分别配制成质量浓度为20，40，60，80，100 mg/L标准系列，现配现用。以质量浓度(X)对峰面积(Y)作图绘制标准曲线。

（3）样品的测定。将制得的发酵液于转速为4 000 r/min离心20 min，定容后取上层清液5 mL真空浓缩至干，用质量分数为25%甲醇水溶液溶解并定容至10mL，测定之前用0.22 μm微孔滤膜过滤。将样品的峰面积数值代入标准曲线Y=AX+B，即可求出样品中黄酮的质量分数。

1.3.6 黄酮提取率（质量分数）的计算

黄酮提取率（mg/g）=发酵液中黄酮的质量/葛根的质量，

黄酮质量浓度=样品中黄酮的质量/样品的体积。

1.3.7 葛根核桃蛋白发酵液感官评定

请10位有经验的实验室技术人员，根据葛根核桃复合发酵液的乳清析出情况、沉淀情况、口感、风味等多方面进行综合评分，取其平均值作为最后的感官评分（百分制），评分标准如表1所示。

表1 复合发酵饮料的评分标准

2 结果与分析

2.1 葛根素标准曲线的绘制

以葛根素质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制葛根素标准曲线。回归方程：y=84.782x+50.276，R2=0.9995，表明在葛根素质量浓度为20～100 mg/L的范围内，曲线的线性关系很好。葛根素标准品和样品的色谱图如图1所示。

图1 高效液相色谱

2.2.1 原料配比对黄酮提取率和感官评分的影响

实验操作如同1.3.3，其中核桃饼粕与葛根的比例分别为3:1，2:1，1:1，1:2，1:3，实验结果如图2所示。由图1可以看出，随着葛根添加量的增大，黄酮提取率和感官评分均逐渐增大，综合考虑，选择1:2为核桃饼粕和葛根的最佳原料配比。

图2 原料配比对黄酮提取率和感官评分的影响

2.2.2 蔗糖添加量对黄酮提取率和感官评分的影响

实验操作同1.3.3，其中核桃饼粕与葛根的比例为1:2，蔗糖的添加量分别为0%，0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，结果如图3所示。由图3可以看出，随着蔗糖添加量的增大，黄酮提取率先增大后减小，感官评分逐渐增大，这是因为，随着蔗糖的增加，饮料的甜味增加，酸甜比更加适宜，但是过多的糖对微生物生长会产生抑制效应，不利于产物的生成。因此，蔗糖的最适添加量为1%。

图3 蔗糖添加量对黄酮提取率和感官评分的影响

2.2.3 接种量对黄酮提取率和感官评分的影响

实验操作同1.3.3，其中原料配比为1:2，蔗糖添加量为1%，接种量分别为2%，4%，6%，8%，10%，结果如图4所示。由图4可以看出，随着接种量的增大，在相同的时间内消耗营养物质较多，不利于产物的生成。综合考虑，接种量选择4%为最佳。

2.2.4 温度对黄酮提取率和感官评分的影响

实验操作同1.3.3，其中原料配比1:2，蔗糖添加量1%，接种量4%，发酵温度分别为35，37，39，41，43 ℃，结果如图5所示。由图5可以看出，当温度高于3 7℃时，不利于黄酮的提取，而温度高于39℃时，发酵液有异味。因此，选择37℃为最适发酵温度。

2.2.5 发酵时间对黄酮提取率和感官评分的影响

实验操作同1.3.3，其中原料配比1:2，蔗糖添加量1%，接种量4%，发酵温度37℃，发酵时间分别为0.5，1，1.5，2，2.5，3 d，结果如图6所示。由图6可以看出，随着发酵时间的延长，黄酮提取率逐渐增大，但2 d后，增大不明显，且发酵液出现明显异常的酸味。综合考虑，发酵时间选择2 d为最佳。

图4 接种量对黄酮提取率和感官评分的影响

图5 发酵温度对黄酮提取率和感官评分的影响

2.2.6 固液比对黄酮提取率和感官评分的影响

实验操作同1.3.3，其中原料配比1∶2，蔗糖添加量1%，接种量4%，发酵温度37℃，发酵时间2 d，固液比分别为1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，结果如图7所示。由图7可以看出，随着液体的增多，黄酮提取率逐渐增大，当液体大于15 mL/g时，黄酮提取率增大不明显且发酵液的风味变淡。因此，最佳固液比为1∶15。

2.3 正交优化

在单因素试验的基础上，选择影响较大的原料配比、接种量、温度三因素为考察因素进行L9(33)的正交试验，其因素水平表如表2所示，并以黄酮提取率（mg/g）和感官评分为评价指标筛选最佳工艺条件。黄酮提取率和感官评分的正交试验直观分析分别如表3和表4所示。

图7 固液比对黄酮提取率和感官评分的影响

表2 因素水平

表3 L9(33)黄酮提取率正交试验直观分析

由表3可以看出，影响黄酮提取率的因素顺序为：原料配比＞温度＞接种量，以原料配比的影响最大，极差分析的最佳发酵工艺条件为A3B2C3。由表4可以看出，影响感官评分的因素顺序为：接种量＞原料配比＞温度。与黄酮提取率的正交优化结果相比，虽然影响的主次因素不同，但提取的最佳工艺仍为A3B2C3。因此，以黄酮提取率和感官评分为指标的最佳发酵工艺条件为原料配比1∶3，接种量4%，温度39℃，蔗糖添加量1%，固液比1∶15，发酵时间2 d。在此条件下所制备的葛根核桃复合饮料口感较好，黄酮提取率达3.812 mg/g。

2.4 产品质量指标

2.4.1 感官指标

色泽偏黄，均匀一致，酸甜适口，口感细腻、柔和，粘稠适中，无分层及沉淀现象，既有浓郁的乳酸菌发酵风味，又兼有葛根的清香和核桃的香味，无任何异味。

表4 L9(33)感官评分正交试验直观分析

2.4.2 理化指标

蛋白质1.25%；多肽12 mg/mL；酸度77 °T；脂肪1.1%；黄酮0.2 mg/mL；稳定剂等符合GB2760-2011食品添加剂使用卫生标准；重金属含量低于国家卫生标准。

2.5.3 微生物指标

细菌总数≤100 mL-1；大肠菌群（最近似值）≤0.03 mL-1；霉菌≤10 mL-1；酵母≤10 mL-1；致病菌未检出。

3 结论

以葛根和核桃饼粕为原料，选用乳酸菌发酵，以黄酮提取率和感官评分为指标，在单因素试验的基础上，选择原料配比、接种量、温度三因素为考察因素进行L9(33)的正交实验，最终确定最佳发酵工艺条件：核桃饼粕∶葛根=1∶3，接种量4%，蔗糖添加量1%，固液比1∶15，发酵温度39℃，发酵时间2 d，在此条件下所制备的复合饮料口感较好，黄酮提取率达3.812 mg/g。经调配的乳酸发酵型葛根核桃肽复合饮料稳定性好，酸甜适宜，香味独特。

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