CTHRC1对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

王　成　袁丽萍　殷　麟　张成武　(青海大学附属医院胃肠肿瘤外科，青海　西宁　810001)



CTHRC1对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

王成袁丽萍殷麟张成武(青海大学附属医院胃肠肿瘤外科，青海西宁810001)

〔摘要〕目的观察胶原三股螺旋重复蛋白(CTHRC)1对结直肠癌HT29细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法采用RT-PCR和免疫组织化学方法检测结直肠癌组织中CTHRC1的表达情况。采用电穿孔转染法，将pcDNA3. 1-CTHRC1和CTHRC1 siRNA转染HT29细胞中，通过克隆形成实验检测CTHRC1对HT29细胞增殖的影响;通过伤口愈合实验和Boyden小室检测CTHRC1对HT29细胞迁移和侵袭能力的影响。结果RT-PCR和免疫组织化学检测显示，CTHRC1在结直肠癌组织中的表达显著高于正常对照组织。增殖、迁移和侵袭实验结果显示，对照组、转染CTHRC1和转染CTHRC1 siRNA的结直肠癌HT29细胞克隆形成数分别为(147. 34±15. 86)、(234. 17±27. 86)和(66. 03±8. 95);伤口宽度百分比分别为(1. 00± 0. 00)、(0. 37±0. 12)和(1. 48±0. 35);发生侵袭的细胞数分别为(201. 24±33. 54)、(415. 36±45. 63)和(96. 13±15. 46);转染CTHRC1可显著促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;而转染si-CTHRC1可显著抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结论CTHRC1可明显增加HT29细胞增殖、迁移和侵袭能力，这可能是CTHRC1参与结直肠癌发生发展的机制。

〔关键词〕胶原三股螺旋重复蛋白1;结直肠癌;增殖;迁移;侵袭

尽管结直肠癌的诊断和治疗手段目前都有显著提高，然而手术和化疗的疗效仍然不能令人满意〔1，2〕。胶原三股螺旋重复蛋白(CTHRC)1是一种分泌性糖蛋白，大鼠动脉球囊损伤时，血管外膜成纤维细胞和血管内膜平滑肌细胞CTHRC1的表达显著升高〔3〕。此外研究发现，CTHRC1在多种肿瘤中存在异常的表达，包括黑色素瘤、胃肠道癌、乳腺癌、甲状腺癌、肝癌和胰腺癌〔4～9〕。CTHRC1过表达可通过促进细胞迁移和抑制胶原基质合成而促进损伤组织修复〔10〕。而关于CTHRC1对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力影响的研究还不是很多。本研究拟观察CTHRC1对HT29细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

1　材料与方法

1. 1临床资料选取2012年12月30日至2013年12月30日在我科住院并行手术治疗的结直肠癌患者20例。患者术前

均未接受化学治疗、放射治疗或免疫治疗，收取患者癌组织标本，同时收集10例患者癌旁组织标本作为对照。组织标本离体后10 min内冻存于液氮中保存。每例样本均经过组织病理学诊断证实为结直肠癌。20例患者的平均年龄为(60. 1± 13. 9)岁。

1. 2细胞及试剂人结直肠癌细胞系HT29购自ATCC，细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。转染试剂购自Lonza公司;侵袭实验用Boyden小室购自美国Millipore公司。1. 3 RT-PCR Trizol提取细胞总RNA，反转录成cDNA。PCR反应条件: 95℃5 min，95℃10 s，60℃20 s，共40个循环。CTHRC1上游引物: 5'-GCATGCTGTCAGCGTTGGTA-3';下游引物: 5'-TCAATGGGAAGAGGTCCTGAA-3'。以2-△△Ct方法计数基因的相对表达量。

1. 4免疫组化染色免疫组织化学染色标本采用甲醛固定、石蜡包埋的组织进行，具体操作方法参见文献〔2〕报道。

1. 5电穿孔转染法严格按照试剂盒说明书进行操作。

1. 6克隆形成实验转染pcDNA3. 1-CTHRC1和CTHRC1 siRNA的HT29细胞各5×103接种于6孔板中，培养72 h后，形成的克隆用甲醇固定，并用含0. 1%结晶紫的20%甲醇染色30 min，计数形成的克隆数。

1. 7迁移和侵袭能力检测采用伤口愈合实验方法检测细胞迁移能力，具体操作方法参见文献〔11〕报道。采用Boyden小室分析检测细胞侵袭能力:用于实验的细胞采用台盼蓝染色计数并重悬。将1×105个细胞置于经过铺胶的上层小室中，并补加培养基至300 μl。下层小室中加入含10%胎牛血清的培养基500 μl。孵育12 h后，未发生侵袭的细胞用棉拭子从上层腔室除去。下层小室中的细胞以0. 1%结晶紫固定染色，计算出现侵袭的细胞数。

1. 8统计学方法采用SPSS16. 0软件行t检验。

2　结果

2. 1 RT-PCR和免疫组织化学方法检测CTHRC1在结直肠癌组织中的表达CTHRC1在结直肠癌组织中的表达显著高于正常对照组织。见图1。

图1　 CTHRC1在结直肠癌组织中的表达情况

2. 2克隆形成实验检测CTHRC1对结直肠癌细胞增殖能力的影响对照组、转染CTHRC1和转染CTHRC1 siRNA的结直肠癌HT29细胞克隆形成数分别为(147. 34±15. 86)、(234. 17± 27. 86)和(66. 03±8. 95)，转染CTHRC1可显著促进结直肠癌细胞的增殖能力;而转染si-CTHRC1可显著抑制结直肠癌细胞的增殖能力。见图2。

图2　 CTHRC1对结直肠癌细胞增殖能力的影响

2. 3伤口愈合实验检测CTHRC1对结直肠癌细胞迁移能力的影响对照组、转染CTHRC1和转染CTHRC1 siRNA的结直肠癌HT29细胞在培养24 h后，伤口宽度百分比分别为(1. 00± 0. 00)、(0. 37±0. 12)和(1. 48±0. 35)，转染CTHRC1可显著促进结直肠癌细胞的迁移能力;而转染si-CTHRC1可显著抑制结直肠癌细胞的迁移能力。见图3。

2. 4 Transwell检测CTHRC1对结直肠癌细胞侵袭能力的影响

对照组、转染CTHRC1和转染CTHRC1 siRNA的结直肠癌HT29细胞发生侵袭的细胞数分别为(201. 24±33. 54)、(415. 36±45. 63)和(96. 13±15. 46)，转染CTHRC1可显著促进结直肠癌细胞的迁移能力;而转染si-CTHRC1可显著抑制结直肠癌细胞的迁移能力。见图4。

图3　 CTHRC1对结直肠癌细胞迁移能力的影响

图4　 CTHRC1对结直肠癌细胞侵袭能力的影响

3　讨论

CTHRC1是一个25 kD的分泌性糖蛋白，在多种肿瘤中存在异常的表达〔4～9〕，本研究发现，CTHRC1在结直肠癌组织中的表达较癌旁组织相比显著升高，提示CTHRC1的高表达与结直肠癌的发生发展密切相关。进一步研究发现，CTHRC1与结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭密切相关。过表达CTHRC1的HT-29细胞增殖、迁移和侵袭能力均显著升高，而敲低CTHRC1 的HT-29细胞增殖、迁移和侵袭能力均显著降低。上述结果提示，结直肠癌组织中高表达的CTHRC1可通过促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭参与结直肠癌的发生和发展。

综上所述，CTHRC1在结直肠癌组织中的表达显著上调，且上调表达的CTHRC1参与了结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。初步提示，CTHRC1表达异常参与了肿瘤的发生发展，包括结直肠癌。然而，目前关于CTHRC1发挥作用的分子机制尚未被完全研究清楚。近期研究发现CTHRC1可通过稳定Wnt受体复合物以选择性地激活Wnt信号通路〔12〕。在肿瘤中，CTHRC1可通过激活Wnt/PCP-Rho信号通路促进胃肠道间质瘤侵袭。然而，在结直肠癌的发生发展中CTHRC1通过何种通路调节结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭将是未来我们研究的重点。

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10 Pyagay P，Heroult M，Wang Q，et al．Collagen triple helix repeat containing 1，a novel secreted protein in injured and diseased arteries，inhibits collagen expression and promotes cell migration〔J〕．Circ Res，2005; 96(2): 261-8.

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12 Yamamoto S，Nishimura O，Misaki K，et al．Cthrc1 selectively activates the planar cell polarity pathway of Wnt signaling by stabilizing the Wntreceptor complex〔J〕．Dev Cell，2008; 15(1): 23-36.

〔2015-04-17修回〕

(编辑滕欣航)

通讯作者:张成武(1963-)，男，教授，硕士生导师，主要从事胃肠肿瘤研究。

〔文章编号〕1005-9202(2015)20-5833-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 072

〔文献标识码〕A

〔中图分类号〕R735

第一作者:王成(1971-)，男，硕士，副主任医师，主要从事胃肠肿瘤研究。