主动脉中膜钙化型动脉粥样硬化模型的建立

龚博君　李自成　(暨南大学附属第一医院心血管内科，广东　广州　510632)



主动脉中膜钙化型动脉粥样硬化模型的建立

龚博君李自成(暨南大学附属第一医院心血管内科，广东广州510632)

〔摘要〕目的探讨SD大鼠在维生素D3联合高脂饲料处理下，90 d建立动脉粥样硬化(AS)模型的可行性。方法雄性SD大鼠60只，随机分成:对照组和AS组。对照组予以基础饲料饲养，AS组维生素D3以60万U/kg实验开始前4 d连续腹腔注射，之后以30万U·kg-1·30 d-1的剂量腹腔注射，并联合高脂饲料饲养90 d。检测0、45及90 d血清总胆固醇(TC)、钙离子和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)浓度。HE染色法检测AS过程中主动脉动态病理变化。结果90 d AS组TC、动脉粥样硬化指数(AI)及钙离子浓度显著高于0 d和90 d对照组(均P＜0. 05)，90 d时出现主动脉中膜钙化型AS斑块。结论SD大鼠在维生素D3联合高脂饲料处理下，90 d成功构建了主动脉中膜钙化型AS模型。

〔关键词〕动脉粥样硬化;维生素D3;动物模型

冠心病是发达国家死亡的主因，其在国内外的发病规律存在着年龄、种族、地域及性别的差异。动脉粥样硬化(AS)是冠心病的基础病理变化，与多危险因素〔1〕关系密切，如高脂血症、高血压及糖尿病等。早期研究发现多种动物在相关实验条件诱导下可形成AS动物实验模型。尽管目前有关AS机制的研究较多，但基于其发病原因的复杂性，具体机制尚未明确。本研究旨在通过应用高脂饲料诱导高脂血症发生，进一步应用大剂量维生素D3改变动物体内钙离子浓度，通过高脂血症联合钙超载方式建立主动脉中膜钙化型AS模型。

1　材料与方法

1. 1实验动物及分组6～8周龄SPF级雄性SD大鼠60只，体重160～200 g，购自广东省医学实验动物中心，饲养于暨南大学医学实验动物中心SPF级环境中。随机分成2组，对照组及AS组，每组30只。在实验过程中，对照组第0天、45天及90天分别处死10只大鼠，AS组第0天、45天及90天分别处死10只、10只及8只大鼠。

1. 2高脂饲料配方胆固醇4%，胆酸钠0. 5%，猪油10%，白糖5%，丙硫氧嘧啶0. 2%，基础饲料80. 3%。购自广东省医学实验动物中心，生产许可证号: SCXK(粤)2008-0002。

1. 3维生素D3注射液产自上海通用医药有限公司，购自广州，批准文号: H31021404。

1. 4造模方式AS组实验开始前4 d予以维生素D3 60万U·kg-1·d-1腹腔注射，之后每30天以30万U·kg-1腹腔注射，并给予高脂饲料饲养;对照组予以普通饲料饲养。

1. 5指标检测方法实验开始、每30 d及每45 d称量各组动物体重。实验开始前、第45天及第90天将动物隔夜禁食，并于次日清晨8点两组各随机抽取10只，10%水合氯醛麻醉后，用抗凝或不抗凝生化管腹主动脉采血，离心，于采血当日进行血清总胆固醇(TC)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及钙离子浓度检测，以上3种成分的检测方法分别为酶耦联比色法、沉淀分离法和酶联免疫法。并计算动脉粥样硬化指数(AI)。

1. 6腹主动脉HE染色采血结束后用4%甲醛充分行心脏灌洗，根据动物解剖结构分离主动脉从升主动脉起直至降主动脉末，将主动脉纵向剖开，分离脂肪组织，将主动脉浸泡于4%甲醛中，固定时间控制在约24 h内，之后以浓度梯度乙醇脱水，二甲苯透明，包埋后切片，并行HE染色。

1. 7统计学处理应用SPSS17. 0软件行方差分析。

2　结果

2. 1一般情况AS形成过程中AS组与对照组大鼠比较，AS组大鼠毛色晦暗，出现尿量增多，反应迟钝等表现，全过程体重无明显增加。AS模型建模成功率80%(8/10)。

2. 2血清学指标在各组间的比较AS组45 d和AS组90 d 的TC及钙离子水平与AS组0 d比较，差异显著(均P＜0. 05)，AS组90 d TC及钙离子水平与AS组45 d及对照组90 d间比较，差异有统计学意义(均P＜0. 05)，见表1。

2. 3体重和AI在各组间的比较体重在对照组0 d、45 d及90 d间的比较差异显著(均P＜0. 05)。AIAS组45 d、AS组90 d 与AS组0 d比较差异显著(均P＜0. 05)，见表2。

2. 4 HE染色对照组0 d，45 d及90 d主动脉HE染色均未见病理改变。AS组SD大鼠主动脉病理学HE染色动态改变结果如下所示: 0 d AS组结果为主动脉结构完整，内膜、中膜及外膜清晰可见，中膜可见梭型平滑肌细胞，无病理学改变。45 d AS组结果为主动脉部分内膜部分区域稍有破损，中膜可见散在分布钙化灶存在，非钙化区且平滑肌细胞排列紊乱，钙化区域无法找到平滑肌细胞。90 d AS组结果中膜可见大量钙化灶及斑块，无法找到平滑肌细胞，见图1。

表1　一般生化学指标的比较(x±s，mmol/L，n=10)

表2　 AS形成过程中体重和AI的比较(x ±s，n=10)

图1 AS组主动脉病理变化( HE)

3　讨论

继1908年国外学者采用蛋和奶饲养出兔AS模型后，国内外多数研究者以AS成机制为研究突破口，探讨并研究出较多的AS动物模型:①以兔〔2，3〕为研究对象，基础饲料并低浓度胆固醇混合高脂饲料饲养法，1913年第一次成功建立兔AS模型，以兔为模型的研究虽较常用，但饲养费用较高;②也有学者用狒狒〔4〕、猴、狗和猪等在高脂饲料饲养基础上历经长达约12个月建立AS模型，尽管此模型斑块形成过程与人类斑块过程极为类似，但耗力、耗时、耗财，且相关动物不易获取，应用以上动物造模以国外多见;③国内外学者还将apoE-/-小鼠〔5〕、SHR大鼠及转基因兔等动物应用免疫损伤〔6〕、主动脉球囊损伤并高脂饲料等方法建模，自从1992年两项有关apoE基因敲除小鼠的重要研究在《Science》及《Cell》杂志发表后，应用转基因动物建立AS模型愈来愈受到欢迎，此种动物不仅抗AS作用弱，干扰小，其造模结果与人类AS病变过程极为类似，且造模成功率高，成模周期短，但费用高，采血量少，以组织研究多见。总之，采用apoE基因敲除小鼠造AS模型仍然引领着主流方向。

在应用非基因敲除鼠类建立AS模型过程中，国内外研究主要以维生素D3或维生素D2合并不同浓度胆固醇高脂饲料饲养方法建模: 2000年，Bennani-Kabchi等〔7〕采用了维生素D2联合低浓度胆固醇灌胃并基础饲料饲养，90 d造模成功，这是国际上首次用沙鼠造出的AS模型，且在主动脉病变区域找到了纤维帽、脂质核心及钙化灶。2008年，Aubin等〔8〕用单纯高脂饲料饲养8 w，仅出现高脂血症模型。2010年，Pang等〔9〕用维生素D3以70万U·kg－1·d－1连续4 d腹腔注射并4%胆固醇的高脂乳剂灌胃加基础饲料饲养，3个月建立SD大鼠AS模型。此外，也有研究者采用雄性SD大鼠联合维生素D3肌注并高脂饲料饲养建模。本研究为降低实验费用，方便实验操作，采用4%胆固醇高脂饲料并维生素D3腹腔注射的方法建立SD大鼠AS模型。

维生素D3联合高脂饲料为何能建立主动脉中膜钙化性AS模型?一方面: Ca2+是机体内重要的第二信使，既往报道血管壁脂质条纹、纤维斑块及晚期复合斑块内钙含量分别为健康血管钙浓度的13倍、24倍及80倍。当无活性的维生素D3进入肠道后，可促进肠道对钙离子吸收，促使机体内无论是血浆中还是细胞内钙离子水平上升，从而可能通过“钙超载”与氧化应激共同作用的机制促进钙化型AS斑块形成，但有关钙超载与AS的具体机制仍有待探究;另一方面: Cardús等〔10〕考虑与血管内皮细胞生长因子作用下所至的血管平滑肌细胞增生有关;此外，以AS的形成机制为出发点，高脂饲料饲养影响了体内脂类代谢，形成高脂血症状态，因此在高脂血症与高钙血症的协同作用下，更有利于AS形成。

本研究90 d时HE染色可见主动脉大量钙化灶及斑块灶形成，且Ca2+平均浓度在整个AS过程中维持较高水平。AI作为国际上衡量AS严重程度的重要指标，当AI＞4时，说明体内已有粥样斑块形成。本研究中AS组45 d与90 d时，AI均值水平均高于5，主动脉HE染色结果进一步证实90 d成功建立了主动脉中膜钙化型AS模型。此种AS在老年患者中最为常见。本研究为未来老年AS患者钙化型AS提供了较好的实验研究基础。

4参考文献

1 Albuquerque VM，Zírpoli JC，Miranda-Filho DD，et al．Risk factors for subclinical atherosclerosis in HIV-infected patients under and over 40 years: a case——control study〔J〕．Bmc Infect Dis，2013; 13(1): 274.

2 Tian J，Hu S，Han X，et al．Lipopolysaccharide-induced proliferation of the vasa vasorum in a rabbit model of atherosclerosis as evaluated by contrastenhanced ultrasound imaging and histology〔J〕．Inflammation，2012; 35(4): 1530-7.

3 Hur SJ，Min B，Nam KC，et al．Effect of dietary cholesterol and cholesterol oxides on blood cholesterol，lipids，and the development of atherosclerosis in rabbits〔J〕．Int J Mol Sci，2013; 14(6): 12593-606.

4 Vinson A，Curran JE，Johnson MP，et al．Genetical genomics of Th1 and Th2 immune response in a baboon model of atherosclerosis risk factors 〔J〕．Atherosclerosis，2011; 217(2): 387-94.

5 Lee YJ，Koh YS，Park HE，et al．Spatial and temporal expression，and statin responsiveness of galectin-1 and galectin-3 in murine atherosclerosis 〔J〕．Korean Circ J，2013; 43(4): 223-30.

6 Vander Laan P，Reardon C，Getz G. Site specificity of atherosclerosis: siteselective responses to atherosclerotic modulators〔J〕．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004; 24(1): 12-22.

7 Bennani-Kabchi N，Kehel L，Bouayadi F，et al．New model of atherosclerosis in insulin resistant sand rats: hypercholesterolemia combined with D2 vitamin〔J〕．Atherosclerosis，2000; 150(1): 55-61.

8 Aubin MC，Lajoie C，Clément R，et al．Female rats fed a high-fat diet were associated with vascular dysfunction and cardiac fibrosis in the absence of overt obesity and hyperlipidemia: therapeutic potential of resveratrol［J］．J Pharmacol Exp Ther，2008; 325(3): 961-8.

9 Pang J，Xu Q，Xu X，et al．Hexarelin suppresses high lipid diet and vitamin D3-induced atherosclerosis in the rat〔J〕．Peptides，2010; 31(4): 630-8．

10 Cardús A，Parisi E，Gallego C，et al．1，25-Dihydroxyvitamin D3 stimulates vascular smooth muscle cell proliferation through a VEGF-mediated pathway〔J〕．Kidney Int，2006; 69(31): 1377-84.

〔2014-07-11修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

通讯作者:李自成(1962-)，男，博士生导师，主任医师，主要从事冠心病的基础研究。

基金项目:广东省科技计划项目(No. 20101096136);广州市科技计划项目(No. 2010Y1-C941);暨南大学第一临床医学院重点学科基金(No. 2010-4)

〔文章编号〕1005-9202(2015)20-5687-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 004

〔文献标识码〕A

〔中图分类号〕R965. 1

第一作者:龚博君(1987-)，女，硕士，医师，主要从事冠状动脉粥样硬化的基础研究。