硫化氢对糖尿病大鼠心肌钙调蛋白活性和基因表达的影响

杨　锐　贾　强　刘小粉　王元元　李正红　关宿东　马善峰　(蚌埠医学院，安徽　蚌埠　233030)



硫化氢对糖尿病大鼠心肌钙调蛋白活性和基因表达的影响

杨锐贾强刘小粉王元元李正红关宿东马善峰(蚌埠医学院，安徽蚌埠233030)

〔摘要〕目的观察硫化氢(H2S)对糖尿病大鼠心肌肌浆网钙泵(SERCA)活性及钙调控蛋白基因表达的影响。方法雄性SD大鼠随机分为正常对照组(NC组)、糖尿病对照组(DM组)、NaHS治疗组(NaHS+DM组)和NaHS对照组(NaHS组)。采用链脲佐菌素(STZ)55 mg/kg腹腔注射诱导糖尿病大鼠模型。测定大鼠的心系数; HE染色观察心肌组织的病理学变化;利用无机磷比色法测定大鼠心肌SERCA活性; RT-PCR检测心肌组织SERCA、受磷蛋白(PLB)、兰尼碱受体2型(RyR2)和1，4，5-三磷酸肌醇受体2型(IP3R2)的基因表达。结果与NC组相比，NaHS组各项指标均无显著差异(P＞0. 05);而DM组心系数明显增大(P＜0. 01);心肌纤维排列紊乱，细胞肿胀明显，有炎细胞浸润;心肌SERCA的活性明显降低(P＜0. 01); SERCA、RyR2和IP3R2mRNA表达降低(P＜0. 01)，PLB mRNA表达增加(P＜0. 01)。与DM组相比，NaHS+DM组心系数明显降低(P＜0. 01)，心肌病理学变化明显改善，SERCA活性明显增加(P＜0. 01)，SERCA、RyR2和IP3R2mRNA表达明显增加(P＜0. 01)，PLB mRNA表达降低(P＜0. 01)。结论H2S对糖尿病大鼠心肌损伤具有保护作用，其机制可能与调节钙调控蛋白的基因表达，增强钙泵活性有关。

〔关键词〕硫化氢;糖尿病;心肌;肌浆网钙泵;钙调控蛋白

糖尿病心肌病是糖尿病(DM)并发的心血管疾病，其病理改变主要表现为心肌细胞肥大、变性、灶性坏死，肌丝纤维大量丢失，心肌细胞外间质有不溶性胶原蛋白积聚、纤维化〔1〕。迄今为止，糖尿病心肌病的确切病因仍不清楚，目前认为其发生与自由基损伤、心肌细胞内异常的钙离子代谢等有关。细胞内Ca2+浓度是心肌收缩和舒张的重要物质基础，肌浆网对Ca2+的摄取和释放是调控细胞内钙稳态的关键环节〔2〕。正常心肌收缩和舒张依赖Ca2+调控蛋白的交互作用，主要包括肌浆网Ca2+-ATP酶(SERCA)、受磷蛋白(PLB)、兰尼碱受体2型(RyR2)、1，4，5-三磷酸肌醇受体2型(IP3R2)〔3〕。硫化氢(H2S)是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第3种新型气体信号分子〔4〕，研究报道了H2S对心血管系统具有重要的生理作用〔5〕。但关于H2S对DM大鼠心肌的钙调控蛋白方面的影响未见相关报道。本研究在复制DM大鼠模型的基础上，观察H2S对DM大鼠心肌肌浆网钙泵的活性及钙调控蛋白的基因表达，探讨H2S对糖尿病心肌损伤的保护机制。

1　材料与方法

1. 1动物健康雄性SD大鼠，32只，清洁级，体重180～220 g，由安徽医科大学实验动物中心提供。

1. 2主要药品和试剂链脲佐菌素(STZ)和硫氢化钠(NaHS)均购自Sigma公司; Ca2+-ATPase试剂盒和考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所; RNAiso Plus试剂和RT-PCR逆转录试剂盒均购自TaKaRa公司; PCR试剂盒购自Fermentas公司; SERCA、PLB、RyR2、IP3R2和β-actin引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。所用SERCA引物:上游5'-AAG CAG TTC ATC CGC TAC CT-3'，下游5'-AGA CCA TCC GTC ACC AGA TT-3'，扩增产物长度为134 bp; PLB引物:上游5'-TAC CTT ACT CGC TCG GCT ATC-3'，下游5'-CAG AAG CAT CAC AAT GAT GCA G-3'，扩增产物长度为141 bp; RyR2引物:上游5'-ACT GCT AAA GTG ACC AAC AG-3'，下游5'-TTG CAT CGC TGA AAT CTA GT-3'，扩增产物长度为430 bp; IP3R2引物:上游5'-GCA GTT GAC TGA GGC GTC TT-3'，下游5'-GGA TTC GTG AGT GGC GAT AC-3'，扩增产物长度为421 bp;β-actin引物:上游5'-GAT GGT GGG TAT GGG TCA GAA GGA C-3'，下游5'-GCT CAT TGC CGA TAG TGA TGA CT-3'，扩增产物长度为630 bp。

1. 3动物模型制备及分组雄性SD大鼠32只，适应性饲养1 w后随机分为正常组16只，DM组16只。DM组大鼠空腹12 h后，一次性腹腔注射STZ 55 mg/kg，72 h后测空腹血糖值，取血糖值≥16. 7 mmol/L为DM模型，并随机分为DM对照组(DM组)和NaHS治疗组(NaHS+DM组)，每组8只。将正常大鼠随机分为:正常对照组(NC组)，NaHS对照组(NaHS组)，每组8只。从造模成功后第4周起，NaHS组和NaHS+DM组开始腹腔注射NaHS溶液14 μmol·kg－1·d－1〔6〕(NaHS作为外源性H2S供体)，持续注射5 w。

1. 4心系数的测定大鼠实验前禁食12 h，自由饮水，称取大鼠体重(g)。大鼠置于断头器上断头，取出心脏，放入生理盐水中洗净血液，用滤纸吸干后，称取心脏重量(mg)，以心重/体重比为心系数。

1. 5心肌细胞苏木素-伊红(HE)染色取心肌组织，置于10%中性甲醛固定，石蜡包埋、切片，HE染色后，光学显微镜下观察。

1. 6 SERCA活性的测定称取50 mg心肌组织，制备心肌肌浆网〔7〕。用无机磷比色法测定。

1. 7 RT-PCR检测SERCA、PLB、RyR2和IP3R2mRNA表达采用RNAiso Plus试剂提取左心室心肌组织总RNA。以总RNA为模板，根据反转录试剂盒要求反转录合成cDNA。以此cDNA为模板，进行PCR扩增。扩增条件: 95℃预变性3 min后，以①95℃变性50 s，②SERCA退火温度52. 4℃45 s，PLB退火温度54. 5℃45 s，RyR2退火温度50. 3℃45 s，IP3R2退火温度54. 5℃45 s，β-actin退火温度59. 4℃45 s;③72℃1 min，反应30个循环，最后一轮72℃延伸10 min。取5 μl PCR扩增产物，在含有溴乙啶的1. 5%琼脂糖凝胶中电泳。在GIS凝胶处理系统中拍摄记录，用电泳凝胶图像分析系统分析计算各目的基因与β-actin条带光密度比值(SERCA/β-actin; PLB/β-actin; RyR2/β-actin; IP3R2/β-actin)表示mRNA相对表达量。

1. 8统计学处理采用SPSS13. 0统计软件，数据以x ±s表示。多组间采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。

2　结果

2. 1 HE染色观察心肌组织病理学变化NC组大鼠心肌纤维排列整齐，未发现变性、坏死等病理改变，心肌细胞核清晰，着色正常，心肌间隙正常; DM组心肌纤维排列紊乱，心肌细胞肿胀明显，心肌间隙增宽，有炎细胞浸润，胞质分布不均匀; NaHS+DM组心肌损害明显改善，可见大部分心肌细胞排列整齐，结构完整，仅部分细胞有水肿，少数有心肌溶解、断裂或间隙加宽，炎细胞浸润减少; NaHS组心肌组织无异常改变。见图1。

图1　四组大鼠心肌组织病理学变化(HE，×400)

2. 2各组大鼠心系数的变化NC组和NaHS组大鼠体重和心脏重量无显著差异(P＞0. 05);与NC组比较，DM组大鼠体重和心脏重量均降低(P＜0. 01)，心系数增大(P＜0. 01);与DM组比较，NaHS+DM组大鼠体重和心脏重量均增加(P＜0. 05)，心系数降低(P＜0. 01)。见表1。

表1　各组大鼠体重、心脏重量和心系数的变化(x±s，n=8)

与NC组比较: 1)P＜0. 01;与DM组比较: 2)P＜0. 05，3)P＜0. 01

2. 3心肌组织SERCA活性与NC组比较(4. 34±0. 56)，NaHS组SERCA活性无显著差异(4. 21±0. 43，P＞0. 05);而DM 组SERCA活性明显下降(2. 67±0. 45，P＜0. 01)。与DM组比较，NaHS+DM组SERCA活性明显升高(3. 39±0. 37，P＜0. 01)，见表2。

2. 4心肌组织SERCA、PLB、RyR2和IP3R2mRNA的表达与NC组比较，NaHS组各项指标无显著差异(P＞0. 05);而DM组SERCA、RyR2和IP3R2mRNA表达降低(P＜0. 01)，PLB mRNA表达增加(P＜0. 01)。与DM组比较，NaHS+DM组SERCA、RyR2和IP3R2mRNA表达增加(P＜0. 01)，PLB mRNA表达下降(P＜0. 01)。见表2，图2。

表2　 SERCA、PLB、RyR2和IP3R2mRNA在大鼠心肌组织中的表达(x±s，n=8)

图2　 SERCA、PLB、RyR2和IP3R2mRNA凝胶电泳图

3　讨论

糖尿病心肌病是由DM引起的心脏微血管病变、心肌代谢紊乱及纤维化等所导致的心肌结构异常，最终引起左心室肥厚、舒张期和(或)收缩期功能障碍的一种疾病。本研究结果显示DM大鼠的心脏已发生肥厚性改变，补充外源性H2S可以减轻DM大鼠的心肌损伤。

H2S被认为是调节心血管功能的内源性气体信号分子〔8〕。内源性H2S是由半胱氨酸磷酸吡多醛-5'-磷酸依赖性酶包括胱硫醚-β-合成酶、胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)及半胱氨酸转移酶等催化作用下产生，其中CSE主要表达于血管组织和心肌中〔9〕。苏钰雯等〔10〕研究发现，内源性H2S对阿霉素心肌病大鼠的心肌组织具有保护作用，心肌组织中适宜的H2S水平对维持心肌组织正常结构与功能具有重要调节作用。Ca2+是心肌兴奋-收缩耦联的重要因子。当心肌细胞兴奋时，细胞膜上L型Ca2+通道开放，Ca2+顺浓度差从胞外进入胞内，并且触发心肌细胞内的肌浆网(SR)钙释放通道打开，大量的Ca2+从SR进入胞内，引起胞内的Ca2+浓度的显著增高，这一过程为钙触发钙释放，最终引起心肌的收缩。而心肌的舒张主要与SERCA有关，SERCA负责肌浆网对Ca2+的摄取，PLB是SERCA活性的抑制蛋白，而RyR2、IP3R2是肌浆网上Ca2+的释放通道〔3〕。通过摄取和释放Ca2+，SR在心肌收缩和舒张过程中发挥重要作用。当SR的钙调蛋白功能发生异常时，会引起Ca2+代谢紊乱，容易导致心肌舒缩功能不全。高血糖会引起心肌细胞内钙超载致心肌收缩功能减弱〔11〕。研究表明，DM大鼠心肌SERCA基因及蛋白水平下降〔12〕，PLB基因及蛋白水平增加〔13〕，RyR2、IP3R2基因表达减少〔14〕。本实验结果证实，DM会引起心肌细胞发生钙调控异常，最终导致心肌舒缩功能不全。本外源性补充H2S可以减轻心肌细胞钙超载，改善DM大鼠的心肌舒缩功能，从而减轻DM对大鼠心肌的损伤。

4参考文献

1 Bell DS. Diabetic cardiomyopathy〔J〕．Diabet Care，2003; 26(10): 2949-51.

2 Sheikh AQ，Hurley JR，Huang W，et al．Diabetes alters intracellular calcium transients in cardiac endothelial cells〔J〕．PLoS One，2012; 7(5): e36840.

3周斌全，胡申江.糖尿病大鼠心肌超微结构及钙离子调控蛋白基因表达的改变〔J〕．浙江大学学报(医学版)，2005; 34(5): 454-8.

4 Lowicka E，Beltowski J. Hydrogen sulfide(H2S)-the third gas of interest for pharmacologists〔J〕．Pharmacol Rep，2007; 59(1): 4-24.

5 Lavu M，Bhushan S，Lefer DJ. Hydrogen sulfide-mediated cardioprotection: mechanisms and therapeutic potential〔J〕．Clin Sci，2011; 120(6): 219-29.

6 Gao Y，Yao X，Zhang Y，et al．The protective role of hydrogen sulfide in myocardial ischemia-reperfusion-induced injury in diabetic rats〔J〕．Int J Cardiol，2011; 152(2): 177-83.

7 Bin G，Fen QY，Hua LX，et al．Dysfunction of myocardial sarcoplasmic reticulum in rats with myocardial calcification〔J〕．Life Sci，2005; 77(9): 966-79.

8杜军保，陈晓波，耿彬，等.硫化氢作为心血管信号分子的研究〔J〕．北京大学学报:医学版，2002; 34(2): 187.

9 Eto K，Ogasawara M，Umemura K，et al．Hydrogen sulfide is produced in response to neuronal excitation〔J〕．J Neurosci，2002; 22(9): 3386-91.

10苏钰雯，杜军保，韩薇，等.内源性硫化氢对阿霉素心肌病大鼠心肌结构的影响〔J〕．临床儿科杂志，2007; 25(10): 828-31.

11马善峰，贾强，关宿东，等.大豆异黄酮对糖尿病大鼠心肌组织NO含量和NOS活性的影响〔J〕．中药新药与临床药理，2006; 17(2): 89-92.

12 Zhao XY，Hu SJ，Li J，et al．Decreased cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase activity contributes to cardiac dysfunction in streptozotocin-induced diabetic rats〔J〕．J Physiol Biochem，2006; 62(1): 1-8.

13 Qi MY，Xia HJ，Dai DZ，et al．A novel endothelin receptor antagonist CPU0213 improves diabetic cardiac insufficiency attributed to up-regulation of the expression of FKBP12. 6，SERCA2a，and PLB in rats〔J〕．J Cardiovasc Pharmacol，2006; 47(6): 729-35.

14 Yaras N，Ugur M，Ozdemir S，et al．Effects of diabetes on ryanodine receptor Ca2+release channel(RyR2)and Ca2+homeostasis in rat heart 〔J〕．Diabetes，2006; 54(11): 3082-8.

〔2014-07-04修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

Effect of hydrogen sulfide on activity and gene expressions of calcium regulatory proteins in diabetic rats

YANG Rui，JIA Qiang，LIU Xiao-Fen，et al．
Bengbu Medical College，Bengbu 233030，Anhui，China

【Abstract】Objective To investigate the effect of hydrogen sulfide(H2S)on sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase(SERCA)activity and gene expressions of calcium regulatory proteins in diabetic rats．Methods Thirty-two male SD rats were divided into four groups randomly: normal control(NC)，diabetic(DM)，NaHS + diabetic(NaHS+DM)and NaHS groups(NaHS)．Diabetic rat was induced by injection of streptozotocin at 55 mg/kg intraperitoneally．After 8 weeks，heart weight/body weight were determined．The pathological changes of myocardial tissue were observed by HE staining，and the activity of SERCA was analyzed by colorimetric method of inorganic phosphorus．The expressions of SERCA，PLB(phospholamban)，RyR2(ryanodine receptor type 2)and IP3R2(1，4，5-trisphosphate inositor type 2)at mRNA level in myocardium were detected using RT-PCR．Results There were no significant differences in all indexes between NC and NaHS groups(P＞0．05)．However，compared with NC group，in diabetic rats，heart weight/body weight were increased(P＜0．01)．Cardiac muscle fibers were disorder，and myocytes were edema and hypertrophy，with inflammatory cell infiltration enhanced．The activity of SERCA was decreased(P＜0．01)．The mRNA levels of SERCA，RyR2and IP3R2 were decreased(P＜0．01)，PLB mRNA was increased(P＜0．01)in DM group．Compared with DM group，heart weight/body weight was decreased(P＜0．01)and the injury of myocardiac myofibrillae was attentuated in NaHS+DM group．SERCA activity was increased(P＜0．01)．The mRNA levels of SERCA，RyR2and IP3R2 were increased(P＜0. 01)，PLB mRNA was decreased(P＜0．01)．Conclusions H2S can protect myocardium in diabetic rats，it is related to regulating the gene expressions of calcium regulatory proteins and enhancing the activity of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase．

【Key words】Hydrogen sulfide; Diabetes mellitus; Myocardium; Sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase; Calcium regulatory proteins

通讯作者:马善峰(1971-)，男，博士，副教授，硕士生导师，主要从事心血管生理学研究。

基金项目:安徽省教育厅自然科学研究项目(No．KJ2015A163; KJ2013B146; KJ2015B006by);蚌埠医学院科研项目(No．BY0907; BYKY1312; BYKY1414ZD)

〔文章编号〕1005-9202(2015)20-5697-04;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 008

〔文献标识码〕A

〔中图分类号〕R363. 2

第一作者:杨锐(1982-)，女，硕士，讲师，主要从事心血管生理学研究。