海马认知障碍对血脂水平的影响及其与肝脏HMG-CR表达的关系

韦日明　李统四郭亚芬杜　森　夏春波　(桂林医学院，广西　桂林　54004)



海马认知障碍对血脂水平的影响及其与肝脏HMG-CR表达的关系

韦日明李统四1郭亚芬2杜森夏春波(桂林医学院，广西桂林541004)

〔摘要〕目的探讨海马认知障碍对血脂水平的影响及其与肝脏3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CR)表达的关系。方法采用Aβ1～42大鼠海马内注射构建认知障碍模型，全自动生化分析仪检测血脂水平，半定量反转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)检测肝脏HMG-CR mRNA的表达，蛋白印迹法检测肝脏HMG-CR的表达。结果①实验组大鼠甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)分别为(2. 30± 0. 08)mmol/L、(4. 60±0. 10)mmol/L、(2. 41±0. 06)mmol/L，与假手术组和对照组相比均显著升高(P＜0. 05)。②实验组大鼠肝脏HMG-CR mRNA表达水平为0. 49±0. 03，明显高于假手术组和对照组(P＜0. 05)。③实验组大鼠肝脏HMG-CR表达水平为0. 50±0. 02，显著高于假手术组与对照组(P＜0. 05)。结论海马认知障碍可引起大鼠血脂水平升高，其机制可能与认知障碍大鼠肝脏HMG-CR表达水平升高有关。

〔关键词〕认知功能障碍;脂代谢; 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶

1岑溪市中医医院2广西大学

第一作者:韦日明(1978-)，男，讲师，广西大学在读硕士，主要从事分子生物学的基础应用和疾病动物模型的研究。

大脑海马与认知功能的关系一直是研究热点〔1〕，但对内脏活动的影响知之甚少。临床上，老年痴呆患者常常伴有代谢水平异常，高达81%的散发性老年痴呆患者有不同程度的代谢异常〔2〕。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CR)是脂代谢的关键酶，为深入揭示认知功能障碍对血脂代谢的影响及其发生机制，本研究通过制备认知障碍模型，分析血脂水平变化与肝脏HMG-CR表达水平的关系。

1　材料与方法

1. 1实验材料与试剂30只健康SD大鼠(雌雄不分，200～250 g)，由桂林医学院实验动物中心提供，合格证号: SCXK桂2007-000。β淀粉样蛋白(Aβ1～42)购自美国Sigma公司，总RNA提取试剂盒以及逆转录试剂盒均为TaKaRa公司产品，HMG-CR、β-actin引物序列由invitrogen公司设计并合成，HMGCR上游引物: 5＇-CCTTCTACCTCAGCAAGCCT-3＇，下游引物: 5＇-GATGCTCAAGCTGCCTTC T-3＇，产物为243 bp;β-actin上游引物: 5＇-GAGGGAAATCGTGCGTGAC-3＇，下游引物: 5＇-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3＇，产物为445 bp。HMG-CRpAb、β-actinpAb 为Bioworld Technology公司产品，辣根酶标记山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1. 2大鼠认知障碍模型制备及实验分组30只健康SD大鼠随机分成三组，每组10只。将大鼠腹腔麻醉(10%水合氯醛，3 ml/kg)，头部备皮，参照《大鼠脑立体定位图谱》将大鼠固定于脑立体定位仪上，沿其头顶切开长约1 cm的纵形切口，分离骨膜，牙科钻在右侧海马上方(前囟后3. 8 mm，右旁开2. 2 mm)打孔。实验组:微量注射器进针2. 9 mm海马内注射Aβ1～4215 μg;假手术组:注射等体积磷酸盐缓冲液(PBS);对照组:不作任何处理。Morris水迷宫实验检测大鼠认知功能，以大鼠逃避潜伏期、在原平台象限时间百分比、跨越平台次数三项指标中的任意两项与对照组差异有统计学意义评定为认知功能障碍。

1. 3大鼠血脂水平的检测大鼠饲养45 d后，腹腔麻醉，胸部备皮，1 ml注射器心脏取血约0. 8～1 ml，分离血浆，全自动生化分析仪检测甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。

1. 4大鼠肝脏组织样本采集大鼠腹腔麻醉，腹部备皮，打开腹腔并剪取部分肝脏组织，快速放入液氮中，12 h后将大鼠肝脏组织从液氮中转移至－80℃冰箱备用。

1. 5 RT-PCR法测定肝脏HMG-CR mRNA的表达水平在液氮中充分研磨肝脏组织，利用TaKaRa总RNA提取试剂盒提取样本总RNA，紫外分光光度计检测总RNA的纯度和浓度，TaKaRa逆转录试剂盒将总RNA逆转录为稳定的cDNA，运用HMG-CR引物和β-actin引物进行PCR扩增，反应条件:预变性94℃2 min，变性94℃30 s、退火63℃30 s、延伸72℃30 s共32个循环，终延伸72℃2 min。1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，全自动数码凝胶成像分析系统拍照，并分析。

1. 6 Western印迹法测定肝脏HMG-CR的表达水平在液氮中充分研磨肝脏组织至粉末状，加入蛋白组织细胞裂解液(RIPA)中15 min，离心并取上清，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒检测组织蛋白质浓度，制备上样蛋白样本，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，蛋白质转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂牛奶封闭，孵育HMG-CR(β-actin)一抗，Tris盐酸缓冲液(TBST)洗膜，孵育二抗，TBST洗膜，PVDF膜发光，测定蛋白条带灰度值，并分析。

1. 7统计学分析应用SPSS17. 0软件行单因素方差分析。

2　结果

2. 1各组大鼠血脂水平比较大鼠饲养45 d后，表现为体型偏瘦、行动迟钝、毛发淡黄且粗糙:实验组大鼠TG、TC、LDL-C均明显高于假手术组和对照组(P＜0. 05)，HDL-C水平无统计学差异(P＞0. 05)。见表1。

2. 2各组大鼠肝脏HMG-CR mRNA的表达情况实验组大鼠肝脏HMG-CR mRNA表达水平为0. 49±0. 03，明显高于假手术组与对照组(分别为0. 24±0. 02和0. 22±0. 01)(P＜0. 05)，假手术组与对照组相比无明显变化(P＞0. 05)。见图1。

2. 3各组大鼠肝脏HMG-CR的表达情况实验组大鼠肝脏HMG-CR的表达水平为0. 50±0. 02，明显高于假手术组(0. 28±0. 02)与对照组(0. 27±0. 03)(P＜0. 05)，假手术组与对照组相比差异无统计学意义(P＞0. 05)。见图2。

表1　各组大鼠血脂水平(x ±s，mmol/L，n=10)

图1　肝脏HMG-CR mRNA的表达

图2　肝脏HMG－CR的表达

3　讨论

老年痴呆也称作阿尔兹海默病(AD)，其主要特征为记忆缺失、认知损害和人格改变，并逐渐进展为严重认知障碍。AD与脂代谢关系密切，有研究表明〔3〕，AD患者体内HDL与TC水平呈动态表达。黄德弘等〔4〕对51例AD、43例血管性痴呆(VD)以及30例正常人血脂检测发现，与正常组相比，AD与VD患者血清TC、LDL-C、TG水平显著升高。也有学者发现，AD患者与正常人相比，TC、LDL、TG水平明显升高〔5〕。另有报道〔6〕，认知障碍大鼠海马神经元凋亡增加，且TC、TG、LDL水平显著升高，推测AD大鼠导致脂代谢异常与海马神经元凋亡增加有关。本实验也提示大鼠认知功能障碍可能会引起血脂水平升高。

HMG-CR是脂质代谢的关键酶〔7〕，蛋白激酶可以催化HMG-CR发生磷酸化从而失去活性。胰高血糖素通过影响蛋白激酶的活性，促使HMG-CR磷酸化，降低胆固醇的合成，而胰岛素则可以通过增加HMG-CR的去磷酸化，提高HMG-CR水平及活性，促进胆固醇的合成。本实验推测认知障碍大鼠血脂水平升高可能与肝脏HMG-CR表达升高有关，但认知障碍大鼠肝脏HMG-CR表达升高的机制尚不清楚。

海马在大脑边缘系统中占有重要的地位，海马神经元凋亡可以促进认知功能障碍的发生发展。海马神经元与周围神经核团广泛联系，如下丘脑室旁核(PVN)、前脑终纹床核(BNST)、杏仁核等。下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA轴)是中枢神经系统参与内脏调节主要通路，HPA轴的激活点位于PVN。研究表明〔8〕，海马可以通过HPA轴参与机体的调节。此外，Guan等〔9〕通过运用显微注射器海马内注射胃动素研究发现，海马可以影响胃肠蠕动，并且海马CA3区的神经元对胃扩张敏感，而膈下迷走神经切断几乎可以完全阻断海马对胃肠动力的影响，提示海马与迷走-迷走神经反射通路之间具有功能性的相互作用。另有研究表明〔10〕，海马可以通过自主神经参与机体的代谢调节。

综上，海马可能会通过多种神经传导通路参与机体代谢调节，推测在本实验中肝脏HMG-CR表达水平升高可能与认知障碍大鼠海马神经元受损有关。

4参考文献

1 Hu R，Huang D，Tong J，et al．Aspartic acid in the hippocampus: a biomarker for postoperative cognitive dysfunction〔J〕．Neural Regener Res，2014; 9(2): 143-52.

2 Biessels GJ，Staekenborg S，Brunner E，et al．Risk of dementia in diabetes mellitus: a systematic review〔J〕．Lancet Neurol，2006; 5(1): 64-74.

3王林辉，田茗源，余刚，等.慢性脑血流灌注不足对老龄大鼠海马组织CA1区ABCA1的表达及脂代谢的影响〔J〕．中国生物制品学杂志，2012; 25(6): 693-6.

4黄德弘，刘孟渊.阿尔茨海默病和血管性痴呆患者血脂、血糖及尿酸水平的变化〔J〕．广东医学，2013; 34(4): 587-9.

5李钦云，陈峥，张守字，等. 126例阿尔茨海默病患者血脂代谢和胰岛素抵抗的研究〔J〕．中华全科医学，2015; 13(1): 15-7.

6杜森，夏春波，叶琳，等.大鼠海马认知障碍对糖脂代谢的影响及其与海马神经元凋亡的关系〔J〕．中国老年学杂志，2015; 35(4): 1000-1.

7 Lin P，He YR，Lu JM，et al．In vivo lipid regulation mechanism of polygoni multiflori radix in high-fat diet fed rats〔J〕．Evid Based Complement Alternat Med，2014; 2014: 642058.

8 Paul S，Jeon WK，Bizon JL，et al．Interaction of basal forebrain cholinergic neurons with the glucocorticoid system in stress regulation and cognitive impairment〔J〕．Front Aging Neurosci，2015; 7: 43.

9 Guan Y，Tang M，Jiang Z，et al．Excitatory effects of motilin in the hippocampus on gastric motility in rats〔J〕．Brain Res，2003; 984(2): 33-41.

10 Mozaffarian F，Jogataii MT，Alizadeh A，et al．Post pubertal behavioral changes in rats with neonatal lesions of the ventral hippocampus〔J〕．Saudi Med J，2011; 32(2): 192-4.

〔2015-02-11修回〕

(编辑袁左鸣)

The effects of cognitive impairment in hippocampus on lipid levels and its relations with the expression of HMG-CR in liver

WEI Ri-Ming，LI Tong-Si，GUO Ya-Fen，et al．
Guilin Medical University，Guilin 541004，Guangxi，China

【Abstract】Objective To investigate the effects of cognitive impairment in hippocampus on lipid levels and its relations with the expression of HMG-CR in liver．Methods The Aβ1～42was injected into the hippocampus of rats to build cognitive impairment model，automatic biochemical analyzer were used to detect lipid levels，the expression of HMG-CRmRNA in liver was detected by RT-PCR，the expression of HMG-CR in liver was detected by Western blot．Results①In experimental group，the levels of total triglyceride(TG)，total cholesterol(TC)，low-density lipoprotein(LDL)were significantly higher than those of sham and control groups(P＜0．05)．②The expression of HMG-CR mRNA in liver of experimental group was significantly increased comparing with that of control and sham groups(P＜0．05)．③The expression of HMG-CR in liver of experimental group was significantly increased comparing with that of control and sham groups(P＜0．05)．Conclusions

Cognitive impairment in hippocampus could cause lipid levels elevating，which might be related to the increasing of the expression of HMGCR in liver．

【Key words】Cognitive impairment; Lipid metabolism; HMG-CR

通讯作者:夏春波(1977-)，男，硕士生导师，副教授，主要从事认知障碍与代谢疾病的研究。

基金项目:国家自然科学基金资助项目(No．81260137)

〔文章编号〕1005-9202(2015)20-5683-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 002

〔文献标识码〕A

〔中图分类号〕R338. 2+6