破壁灵芝孢子粉对裸鼠移植性人乳腺癌的抑制作用

谢　明谭玉林　张　伟　何汉江赵文健资　源郭皖北(湘南学院基础医学部病理研究所，湖南　郴州　420000)



破壁灵芝孢子粉对裸鼠移植性人乳腺癌的抑制作用

谢明1谭玉林张伟何汉江1赵文健1资源1郭皖北
(湘南学院基础医学部病理研究所，湖南郴州420000)

〔摘要〕目的观察破壁灵芝孢子(GLS)粉对人乳腺癌MCF-7细胞移植瘤生长增殖作用和TMSG-1 mRNA表达的影响。方法建立人乳腺癌MCF-7细胞裸鼠移植瘤模型，把30只成瘤裸鼠随机分为五组，每组6只，分别为不同剂量破壁GLS组(1. 5、3、4. 5 g/kg)、磷酰胺(CTX)模型组、生理盐水组。用药4 w后观察破壁灵芝孢子粉对裸鼠移植瘤体积、瘤重的影响，并计算抑制率;用流式细胞术(FCM)测定细胞增殖周期和细胞凋亡水平;用半定量RT-PCR检测肿瘤组织中TMSG-1 mRNA的表达。结果与对照组比较，中剂量和高剂量破壁GLS组(3、4. 5 g/kg)、模型组的移植瘤重瘤体积与对照组比较显著减少(P＜0. 05)，中剂量、高剂量破壁GLS组和模型组的肿瘤抑制率分别为36. 7%、44. 5%、54. 2%;用药4 w后，癌细胞S期和G2/M期细胞所占比例下降，相应的G0/G1期细胞增加，药物抑制了细胞的正常增殖，凋亡实验显示药物组细胞凋亡率增加，药物组总体凋亡率高于对照组(P＜0. 05或P＜0. 01); RT-PCR结果，破壁GLS组(1. 5、3、4. 5 g/kg)可使TMSG-1 mRNA表达明显上调，与生理盐水组比较显著增加(P＜0. 05或P＜0. 01)。结论破壁GLS粉具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用，同时上调MCF-7细胞裸鼠移植瘤组织中TMSG-1 mRNA的表达发挥潜在的抗肿瘤细胞转移的作用。

〔关键词〕裸鼠人乳腺癌移植瘤;破壁灵芝孢子粉; TMSG-1 mRNA;半定量RT-PCR

1免疫学重点学科

第一作者:谢明(1962-)，女，教授，副主任医师，主要从事乳腺肿瘤病理学研究。

灵芝孢子(GLS)是灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来的极其细小的颗粒。它是灵芝的生殖细胞，具有灵芝的全部遗传活性物质，富含蛋白质和氨基酸类、糖肽类、三萜类物质〔1〕。研究表明，GLS粉具有抗肿瘤、免疫调节、保肾护肝、降糖降脂和延缓衰老等功效〔2，3〕。肿瘤的转移是导致患者死亡的主要原因，目前控制肿瘤转移是研究乳腺癌研究的重点，乳腺癌转移抑制基因TMSG-1(也称Rabbit Anti-LASS2)是近年来新发现的一种抑制肿瘤转移和扩散的基因〔4〕。本研究观察不同浓度破壁GLS粉对人乳腺癌裸鼠移植瘤治疗效果和对移植瘤组织中TMSG-1蛋白和mRNA表达的影响。

1　材料与方法

1. 1材料雌性Balb/C小鼠35只，4～6周龄，体重20～22 g，购自中南大学湘雅医学院动物实验部，裸鼠生产许可证号: SCXK(湘)2011-0003，使用许可证SYXK(湘)2011-0001。在SPF条件下饲养于中南大学动物实验部。人乳腺癌细胞株MCF-7细胞由本校化学和生命科学系实验室提供;破壁GLS粉胶囊购于上海市农业科学院茹宝食用菌有限公司(破壁率＞99%)，GLS粉为棕色粉末，体内抑瘤实验前取胶囊内容物于研钵中研磨，用0. 5% CMC-Na配制成不同浓度，高压灭菌。乳腺癌化疗药物磷酰胺(CTX)由江苏恒瑞制药有限公司生产。DMEM培养基、RPMI 1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶和多孔细胞培养板等均购自杭州都俊生物有限公司。RT-PCR盒(Promega公司)，低温高速离心机(天津市泰新特仪器有限公司)，PCR仪(德国Eppendorf公司)。

1. 2方法

1. 2. 1细胞培养和单细胞悬液的制备细胞株MCF-7复苏后置于含10%小牛血清的DMEM培养液中，在37℃、含5% CO2的培养箱中培养，适时传代。取对数生长期细胞，经0. 25%胰蛋白酶消化后吹打成单细胞悬液，600 r/min离心5 min，用无菌PBS重悬细胞并将细胞的浓度调至为5×1010/ml，将细胞悬液分装于5 ml无菌西林瓶中备用。

1. 2. 2动物模型建立、动物分组及给药方法用1 ml注射器注射0. 1 ml的上述细胞悬浮液于每只裸鼠的右腋皮下。接种10 d后，可见接种处微小隆起，并逐渐增大。35只裸鼠中有30只出现肿块，接种成功率为86%。把30只移植瘤接种成功的裸鼠随机分成5组，每组6只。接种26 d瘤体组织达到1 cm3左右时将破壁灵芝孢子粉溶液三组:低剂量GLS组1. 5 g/kg灌胃，1次/d，中剂量GLS组3 g/kg灌胃，1次/d，高剂量GLS组4. 5 g/kg灌胃，1次/d，连续4 w; CTX模型组: CTX 30 mg/kg，腹腔注射，1次/w，连续4 w;生理盐水组:每天灌服相同体积的生理盐水，腹腔注射相同体积的生理盐水。

1. 2. 3观察裸鼠成瘤情况用药后观察裸鼠的一般状况，包括日常活动、精神状态、体重变化。每3天用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)和短径(b)，计算肿瘤体积(V)，V= ab2/2。药物处理4 w后，脱颈椎处死裸鼠，完整剥离肿瘤，并称量重量和测量瘤体的体积。计算抑制率:抑制率=(1－实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100%。

1. 2. 4 RT-PCR检测TMSG-1 mRNA的表达分别选取对照组、1. 5、3及4 g/kg GLS粉溶液组裸鼠肿瘤组织约100 mg制备匀浆。收集细胞，按照Trizol一步法提取MDA-MB-231细胞总RNA，取1 μg RNA经逆转录酶在下列条件下合成cDNA: 25℃5 min，40℃60 min，75℃15 min。然后用该cDNA作为模板进行PCR反应。所有引物均由北京赛百胜基因技术公司合成。TMSG-1(134 bp)上游引物: 5'-TCCTGCCTTCTTTGGCTATTACTT-3';下游引物: 5'-TGCGTTCATCTTCTACCAGCTTTC-3'。用GAPDH扩增产量为内参照(234 bp)上游引物: 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCT-3';下游引物: 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。扩增条件如下: 94℃2 min，94℃40 s、55℃60 s、72℃40 s进行30个循环，72℃延伸10 min终止反应。将TMSG-1和GAPDH扩增产物用1. 5%琼脂糖凝胶电泳后，凝胶图像分析系统行吸光度扫描半定量，测出TMSG-1与内参照GAPDH吸光度扫描值之比作为评价TMSG-1 mRNA表达水平的指标。

1. 2. 5流式细胞仪检测裸鼠移植瘤癌细胞细胞凋亡实验取每只裸鼠的新鲜瘤体组织1～2 mm3，在200目不锈钢筛网上制成单细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，用预冷的75%乙醇固定，再用PBS将细胞浓度调成1×106/ml。碘化丙啶(PI)染色，4℃避光染色30 min。按细胞周期测试盒操作程序测定细胞周期，按细胞凋亡测试盒操作程序分析细胞凋亡率，分析细胞周期分布情况及凋亡细胞所占的比例。

1. 3统计学处理采用SPSS19. 0软件行Dunnett及LSD检验。

2　结果

2. 1裸鼠体内乳腺癌移植瘤生长的影响接种癌细胞10 d后，接种处可见微小突起，以后逐渐变大。35只裸鼠中30只先后出现肿块，接种成功率为87%。癌细胞接种3 w后，30只裸鼠移植瘤长径增至1. 0 cm左右。药物处理后，各组移植瘤继续生长，以中剂量和高剂量的破壁GLS粉溶液组生长较慢，与生理盐水组之间移植瘤生长抑制率均有显著差异(P＜0. 05)。肿瘤体积比较显示，CTX模型组、中、高剂量破壁GLS组与生理盐水组比较有显著差异(P＜0. 01)，见表1。

表1　破壁GLS粉对裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用(x ±s，n=6)

2. 2破壁GLS粉对TMSG-1 mRNA表达的影响RT-PCR检测显示，裸鼠移植瘤经不同浓度破壁GLS粉作用4 w后，TMSG-1 mRNA的表达增加(图1)。对照组OD值为0. 011 7± 0. 051，低、中、高剂量GLS组分别为0. 593 0±0. 207 5，0. 630 6± 0. 165 4，0. 635 12±0. 158 9，破壁GLS粉均高于生理盐水组(P＜0. 01)。但中、高剂量GLS组上调TMSG-1 mRNA的表达状况很相似。

2. 3各组裸鼠移植瘤细胞凋亡的情况不同浓度破壁GLS粉溶液组(1. 5 g/kg、3 g/kg、4. 5 g/kg)作用移植瘤4 w后，FCM-7细胞的S期和G2/M期下降，相应G0/G1期增加。表明细胞用药后DNA复制和分裂活动减弱，药物抑制了细胞周期的正常活动;经不同处理的五组细胞，用药组总体凋亡率高于对照组，模型组、中、高剂量GLS组凋亡率〔(29. 12±5. 23)%、(23. 27± 5. 09)%、(25. 77±1. 06)%〕与对照组、低剂量GLS组差异有统计学意义〔(6. 29±1. 07)%、(16. 29±3. 32)%，P＜0. 05〕。

图1　 RT-PCR检测破壁GLS对裸鼠移植瘤TMSG-1 mRNA表达的影响

3　讨论

TMSG-1在正常人体各组织中均有表达，尤其是在肝脏和肾脏。本实验检测到在正常乳腺组织有高表达，通过细胞免疫组化和组织免疫组化染色检测发现其主要表达在细胞质中，少量细胞核着染。这与马春树等〔5〕研究表示TMSG-1表达主要在细胞质、细胞膜系统是一致的，细胞核着染可能与TMSG-1拥有具有转录因子功能的同源异型结构域有关〔5〕。唐宁等〔6〕研究发现同源基因LASS-2在PCMV-HA2-ASS2质粒转染HCCLM3细胞中高表达，能够促进肿瘤细胞的凋亡，抑制其生长。Mizutani等〔7〕发现TMSC-1对神经酰胺的合成也有影响，而神经酰胺能诱导细胞凋亡〔8〕，表明TMSG-1蛋白的高表达可促进细胞凋亡，从而抑制肿瘤的转移。本实验结果表明，破壁灵芝孢子粉对淋人乳腺癌移植瘤具有一定的抑制作用，近年来对GLS抗肿瘤作用研究广泛，但其作用机制尚不清楚，国内外对破壁灵芝孢子粉抗肿瘤机制研究包括以下几方面:免疫抗肿瘤作用〔9，10〕，抑制肿瘤血管形成〔11，12〕，抑制肿瘤细胞的生长和转移〔13〕，GLS抗肿瘤作用还可能与抑制TOPⅠ，TOPⅡ异构酶，抑制肿瘤细胞端粒酶有关〔14〕。陈娟等〔14〕证实肿瘤细胞凋亡机制是通过上调凋亡基因Bax mRNA，下调抗凋亡基因Bcl-2和Bclxl mRNA的表达实现的，本研究用RT-PCR技术显示破壁GLS粉还能够明显上调乳腺癌细胞TMSG-1 mRNA的表达，降低肿瘤转移性。目前临床肿瘤开展的靶向治疗药物存在有效率低、副作用大、价格高等局限，而中医药抗肿瘤素有“简、便、廉”，中医药治疗能够有效全面改善与调节患者的躯体症状，具有整体、多靶点的疗效特点，成了国内外学者争相研究的热点。因此应用中药治疗肿瘤转移具有一定优势。随着研究的深入，破壁GLS粉的安全性、功能和作用机制将逐渐了解清楚，破壁GLS粉将会有广阔的应用前景。

4参考文献

1陈宝田，龙亚秋，李华.灵芝孢子粉的药理作用研究进展〔J〕．中国

2 Lu QY，Sartippour MR，Brooks MN，et al．Ganoderma lucidum spore extract inhibits endothelial and breast cancer cells in vitro〔J〕．Oncol Rep，2004; 12(3): 659-62.

3 Lin ZB. Cellular and molecular mechanisms of immuno-modulation by Ganoderma lucidum〔J〕．J Pharmacol Sci，2005; 99(2): 144-53.

4马春树，刘域欣，郑杰，等.运用mRNA差异西那是技术克隆肿瘤转移相关基因TSMG-1〔J〕．中国科学(C辑)，2002; 32(3): 270-5.

5马春树，由江峰，郑杰，等.肿瘤转移相关基因TMSG-1编码蛋白的定位〔J〕．肿瘤，2002; 22(6): 445-7.

6唐宁，金浩，邓云，等.人源性长寿保障基因2通过与V-ATPase作用抑制肝癌细胞的生长〔J〕．生理学报，2010; 62(3): 196-202.

7 Mizutani Y，Kihara A，Lgarashi Y. Mammalian Lass6 and its related family members regulate synthesis of specific ceramides〔J〕．Biochem J，2005; 3090(Pt 1): 263-71.

8徐晓燕，裴菲，内江峰，等．新的肿瘤抑制基因(TMSG-1)在肿瘤生物学中的作用〔J〕．癌症杂志，2010; 29(7): 697-702．

9孙丽华，赵明耀，黄幼田，等.灵芝孢子粉对荷瘤小鼠树突状细胞的影响及其抗肿瘤效应〔J〕．山西医药杂志，2006; 35(8): 698-700.

10 Zhang JP，Zheng L，Wang JH，et al．Lipid Extract from completely sporodermbroken germinating ganoderma sinensis spores elicits potent antitumor immune responses in human macrophages〔J〕．Phytother Res，2009; 23(6): 844-50.

11 Gwenaelle S，Kevin H，Veronika S，et al．Ganoderma lueidum suppresses angiogenesis through the inhibition of secretion of VEGF and TGF-β1 from prostate cancer cells〔J〕．Biochem BioPhys Res Commun，2005; 330(1): 46-52.

12王顺官，李琳，徐江平.灵芝孢子粉提取物对裸鼠移植性人肝癌血管生成的抑制作用〔J〕．中药材杂志，2008; 31(8): 1219-22.

13 Sliva D，Sedlak M，Slivova V，et al．Biologic activity of spores and dried powder from Ganoderma lucidum for the inhibition of highly invasive human breast and prostate cancer cells〔J〕．J Altern Complement Med，2003; 9(4): 491-7.

14陈娟，余英豪.破壁灵芝孢子粉对裸鼠移植性淋巴瘤生长的抑制作用〔J〕．中国实验血液学杂志，2012; 20(2): 310-4.

〔2014-06-18修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

通讯作者:郭皖北(1962-)，男，教授，博士，主要从事中西医内分泌疾病治疗研究。

基金项目:湖南省教育科学“十二五”规划2011年度省级课题(No．XJK011CGD038);郴州市科技局立项课题(郴财教指〔2011〕35号);湘南学院免疫学重点建设学科项目(xnxymy2012-125)

〔文章编号〕1005-9202(2015)20-5728-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 020

〔文献标识码〕A

〔中图分类号〕R737. 9